A vizeletben és a húgyhólyagban lévő mikrobióta tényező lehet a húgyhólyagrák kialakulásában. A vizsgálat a férfi betegek vizeletét és húgyhólyagrákos szöveteit, valamint a kontrollok vizeletét fogja megvizsgálni teljes genomiális szekvenálási technikák és 16S rRNS alkalmazásával. A cél a mikrobiota szerepének tisztázása a hólyagban (Cancer bladder)

- Ésszerűség és célok:

A-hólyagrák:

Indoklás A hólyagrák a becslések szerint a kilencedik leggyakoribb rosszindulatú megbetegedés, évente 160 000 vagy több halálesettel világszerte.

Egyre jobban tudatosul a húgyutakban élő mikrobák fontos szerepe, amelyek fontos szerepet játszanak az egészség megőrzésében, valamint a betegségek és a húgyhólyagrák kialakulásában [1].

Jól megalapozott összefüggés van a hólyagrák kialakulása és a specifikus mikrobiális ágensek között [2,3,4,5,].

A gazda-DNS károsodását közvetlenül előidézhetik specifikus E. coli törzsek által termelt genotoxinok, vagy közvetett úton, oxidatív fajok indításával. A mikrobiomnak és termékeinek rákellenes hatása van [6].

Hagyományosan a vizeletet és a húgyhólyag urotheliumot sterilnek tekintették egészséges egyénekben. Ez a koncepció standard mikrobiológiai vizeletkultúrákon alapult. A közelmúltban halmozódó bizonyítékok és bizonyítékok vannak arra vonatkozóan, hogy a húgyutak is különálló kommenzális mikroorganizmusokat tartalmaznak. A vizelet mikrobiomáról számoltak be egészséges egyénekben [7].

A húgyhólyagrákban előforduló húgyúti mikrobiomát ritkán vizsgálták, és arról számoltak be, hogy a Streptococcus sp dúsított a hólyagrákban szenvedő betegek hólyagjában [8].

Bučević Popović V és munkatársai [1] a következőkről számoltak be:" A húgyhólyagrákban szenvedő férfi betegek és egészséges egyének vizeletmintáiban jelenlévő baktériumközösségeket 16S szekvenálás segítségével elemezték. Az eredmények azt mutatják, hogy mindkét csoportban a legelterjedtebb törzs a Firmicutes volt, majd az Actinobacteria, a Bacteroidetes és a Proteobacteria következett. A hólyagrákban jelentősen gazdagodott a Fusobacterium nemzetség, amely egy lehetséges protumorigén kórokozó. Húgyhólyagrákos szövetekben a PCR-rel kimutatott Fusobacterium nucleatum szekvenciák a Veillonella, Streptococcus és Corynebacterium nemzetségek nagyobb mennyiségben voltak jelen az egészséges vizeletben. A Campylobacter hominist húgyhólyagrákos betegek vizeletmintáiban gazdagították, a Campylobacter fajok potenciálisan patogének, mivel toxinokat termelnek, behatolnak a hámsejtekbe, és elkerülhetik a gazdaszervezet immunválaszát.

A mikrobiota tumorszuppresszív hatást fejthet ki az emberi gazdaszervezetben [6]. A következő generációs szekvenálási (NGS) technológiák lehetővé tették a mikrobiális közösségek profilozását meghatározott élőhelyeken. A 16S riboszomális RNS (rRNS) génszekvenálást a mikrobiota profilalkotására használják NGS technológiákkal. A mikrobióta profilalkotási vizsgálatok során fontos, hogy melyik 16S rRNS hipervariábilis régiót válasszuk ki a szekvenciához. Mind a kilenc 16S rRNS hipervariábilis régió taxonómiailag informatív, de a profilalkotási teljesítmény változatossága miatt, az ideális 16S rRNS hipervariábilis régió kiválasztása a vizsgált élőhely bakteriális összetételétől függ. A húgyutat kolonizáló mikrobiális közösségeket (az urobiomot) a V4, V5 azonosítja. A legújabb tanulmányok kimutatták, hogy az urobiom dysbiosis számos urológiai állapothoz [9,10,11] és húgyhólyagrákhoz [12] kapcsolódik.

Célkitűzések: Ezért kulcsfontosságú az urobiom jellemzése az egészségügyben és a hólyagrákban, és új megelőzési, diagnosztizálási és kezelési stratégiákhoz vezethet a hólyagrák esetében.

Célkitűzések A kutatás célja a húgyhólyagrákban szenvedő felnőtt férfi betegek vizelet-mikrobiótájának jellemzése, valamint az egészséges felnőtt férfi kontrollok mikrobiótájával való összefüggés meghatározása.

2-Módszertan 2-1 Vizsgálat típusa: Prospektív esetkontroll vizsgálat 2-2 Befogadási, kizárási kritériumok, toborzási folyamat. [A vizsgálatban részt vevő betegektől tájékoztatáson alapuló beleegyezést kérnek majd, Dr. Loay Mostafa és Dr. Mohamed Sahab az Urológiai Osztálytól – a TBRI lesz felelős ezért a tételért].

Bevételi kritériumok:

• 18 év feletti felnőtt férfiak,
• Képalkotó ultrahanggal és/vagy számítógépes tomográfiával, valamint vizeletcitológiával hólyagkarcinómát diagnosztizáltak.
• Megerősített hólyagrák diagnosztikai cisztoszkópia, korábbi patológia vagy a biopsziás minták patológiás vizsgálata során.

Kizárási kritériumok:

• Korábbi sugárkezelés a hólyagban vagy a szomszédos szervben.
• Korábbi intravesicalis instillációs immunterápia Calmette-Guérin bacillussal (BCG), vagy kemoterápiás szerek intravezikális instillációja.
• Korábbi neoadjuváns kemoterápia. Toborzási folyamat A kizárási és felvételi kritériumokat teljesítő betegek. 2-3 Mintanagyság Harmincnyolc, 18 év feletti egyiptomi férfit vesznek fel a TBRI Urológiai Osztályára az online szoftverrel (Sample Size Calculator) végzett mintanagyság-számítás szerint. Tíz vizeletmintát vesznek normál egyénektől.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html A minta mérete 16 lesz a nem izominvazív hólyagrák (NMIBC) esetében. Ez azt jelenti, hogy 16 vagy több mérés/felmérés szükséges a 95%-os megbízhatósági szint eléréséhez. A minta mérete 11 lesz az izominvazív hólyagrák (MIBC) esetében. Ez azt jelenti, hogy 40 vagy több mérés/felmérés szükséges a 95%-os megbízhatósági szint eléréséhez. A minta mérete 11 lesz a kontrollcsoportban. Ez azt jelenti, hogy 10 vagy több mérés/felmérés szükséges a 95%-os A megbízhatósági szint eléréséhez. 38 férfit vesznek fel a TBRI Urológiai Osztályára. Mintaméret számítás szerint online szoftverrel (Sample Size Calculator). Tizenegy vizeletmintát gyűjtenek a 16-os mintaméretből a nem izominvazív hólyagrák (NMIBC) esetében. Ez azt jelenti, hogy 16 vagy több mérés/felmérés szükséges ahhoz, hogy 95%-os konfidenciaszint legyen, hogy a valós érték ±17,53%-on belül van a mért/felmért értékhez képest.

A minta mérete 11 lesz az izominvazív hólyagrák (MIBC) esetében. Ez azt jelenti, hogy 11 vagy több mérés/felmérés szükséges ahhoz, hogy 95%-os konfidenciaszint legyen, hogy a valós érték ±30,36%-on belül van a mért/felmért értékhez képest.

A minta mérete 11 lesz a kontrollcsoportban. Ez azt jelenti, hogy 11 vagy több mérés/felmérés szükséges ahhoz, hogy 95%-os konfidenciaszint legyen, hogy a valós érték ±30,36%-on belül van a mért/felmért értékhez képest.

normális egyének. Ez a minta a húgyhólyagrák mikrobiomával kapcsolatos kutatást reprezentálja.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Mintagyűjtés

Húgyhólyagrák:

A vizsgált minták teljes száma: A vizsgálat során feltárják a vizeletben és a szövetmintákban található mikrobiótát, így minden hólyagrákos beteg ad (2 mintát). A kontrollcsoport vizeletmintát ad (egy mintát). A közelmúltban végzett kutatások kimutatták, hogy a mikrobióta normális egyedek és húgyhólyagrákos betegek urotéliumában kimutatható, ez a mikrobióta különbözik a vizelet (folyékony) mikrobiótájától.

Referenciák:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Bladder cancer-related microbiota: examining differents in urine and tissue samples. Sci Rep. 2020. július 6., 10(1):11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Profiling the Bladder Microbiota in Patients With Bladder Cancer. Front Microbiol. 2022. február 7.;12:718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   I. csoport: Nem izom-invazív hólyagrák, 16 beteg, 16 hólyagszövet és 16 vizeletminták. Összesen 32 minta. (A vizsgálat a vizeletben és a szövetmintákban lévő mikrobiótát vizsgálja, így minden hólyagrákos beteg ad (2 mintát). A kontrollcsoport vizeletmintát ad (egy mintát). A legújabb kutatások kimutatták, hogy a mikrobiota normális egyedek és hólyagrákos betegek urotheliumában kimutatható, ez a mikrobióta különbözne a vizelet (folyékony) mikrobiótájától. (Referenciák: ) II. csoport: Izominvazív hólyagrák, 11 beteg. 22 minta, 11 húgyhólyagszövet és 11 vizeletminta ugyanazon betegektől. III. csoport: 11 normál felnőtt: a vizsgálat kontrollcsoportjaként a vizeletminták szolgálnak.

   A résztvevők száma összesen 38 fő.

   Minták a mikrobiom elemzéséhez:

   A mintákat tiszta, szivárgásmentes, fertőtlenítő- vagy tisztítószer-maradványok nélküli, szorosan záródó szivárgásmentes tetővel ellátott tartályokba gyűjtik, és hűtőszekrényben tárolják a TBRI mikrobiológiai laboratóriumában történő elemzésig.

   A cisztoszkópiás vizsgálat során vizeletmintákat (50 ml) kell gyűjteni a mikrobiom elemzéséhez. A mintákat -80 °C-on tárolják a feldolgozásig.

   Szövet- és vizeletminták hólyagrákos betegektől: A diagnosztikai cisztoszkópia standard eljárása során teljes aszeptikus körülmények között gyűjtenek vizeletmintát, a hólyagdaganatban szenvedő betegeknél a hólyagdaganat transzuretrális reszekcióját, 0,5x0,5 cm-es szövetmintát vizsgálnak. mikrobiom elemzéshez. A mintákat -80 °C-on tárolják a feldolgozásig. A hematoxilin és eozin festéssel végzett hisztopatológiai diagnózist a WHO 22 és az EAU 2023-as iránymutatásai szerint a tumor fokozata és stádiuma alapján szakértő patológus végzi. Ezt az eljárást mind nem izom-invazív, mind izominvazív uroteliális karcinóma esetén alkalmazzák. A húgyhólyagrák miatt radikális cisztektómián átesett betegek is beleszámítanak a mintába.

   Minták patológiai vizsgálatokhoz:

   A szövetmintákat formalinnal rögzítjük, majd hematoxilin és eozin festéssel vizsgáljuk.

   Klinikai információk Az urológusok megfelelő szövetmintákat biztosítanak, amelyek a teljes kimetszett daganat kis részét vagy a cisztektómiás minták egy részét képezik. patológiai értékeléshez hasznos klinikai információkkal a patológusnak, hogy eldöntse a sebészeti minták kezelésének és feldolgozásának legjobb módszerét, és pontos patológiai jelentést készítsen.

   Az urológus meghatározza:

   • A beteg demográfiai adatai és klinikai kórtörténete, húgyúti fertőzés kórelőzménye, és ha visszatérő vagy szórványos volt, hólyagcitológia, ha jelen van, függetlenül attól, hogy ez a daganat első megjelenése, és ha nem, akkor a korábbi kezelés részletei.
   • A hólyag nyálkahártyájának cisztoszkópos megjelenése és jelzi a daganatok számát, méretét, elhelyezkedését, az elváltozás morfológiai jellemzőit: papilláris, tömör vagy fekélyes.
   • A megmaradt nyálkahártya állapota további biopsziák elvégzése esetén.

   Ezek az információk szükségesek az urothelium helyes értékeléséhez és a mikrobiomában történő kereséshez. Mivel a kezelések hatással lehetnek a tumor morfológiájára és a normális megjelenésű urotheliumra.

   Hólyagrák-minták jelentése

   • Patológiai felmérés A patológus a hólyagszövet biopsziájából származó sejtek vizsgálatával diagnosztizálja a hólyagrák jelenlétét és a hólyagrák típusát. A húgyhólyagrák különböző szövettani daganattípusait jelentik majd a WHO húgyhólyagdaganatok 2016-os osztályozása szerint (Mazzucchelli et al. 2021), amelyet 2022-ben módosítottak.
   • Mikrobiológiai értékelés: Mikroba azonosítási módszerek vizeletből és szövetből

   Klinikai bakteriális izolátumok mintavételi és tenyésztési körülményei:

   Korlátozott számú mikroorganizmus kimutatása, főleg aerob és gyorsan szaporodó baktériumok.

   Bakteriális izolátumok azonosítása: Az izolátumokat véren, MacConkey agaron és sabaruds agaron történő tenyésztéssel azonosítják, majd biokémiai tesztek, oxidáz teszt mannit, epe eszkulin és kataláz teszt elvégzésével azonosítják. Minden izolátumot fajszinten azonosítunk a Vitek 2 kompakt rendszer segítségével.

   2-5 Biokémiai és molekuláris biológiai értékelés: 16S Metagenomikus szekvenálási analízis A teljes genomi szekvenálást (WGS) minden esetben alkalmazzuk, a módszertan és a minőség-ellenőrzés az 57357-es számú gyermekrákkórház genomikai és metagenomikai központjának megfelelően történik, akik a vizsgálatot elvégezni fogják. WGS és 16S szekvenálás vizelet- és szövetmintákon.

1- DNS izolálása vizeletből és szövetből. A vizeletmintákat (50 ml) felengedjük és 7500 g-vel, 4 °C-on 10 percig centrifugáljuk. A pelletet az Invitrogen™ PureLink™ Microbiome DNS-tisztító készlettel történő DNS-kivonáshoz használjuk fel, a gyártó protokollja szerint. A környezetszennyezés elkerülése érdekében a vizeletmintákból és a csak reagens extrakciós kontrollból való minden izolálást PCR-fülke belsejében kell elvégezni. Az izolált DNS-mintákat -20 °C-ra helyezzük a PCR-amplifikációig. A DNS mennyiségi meghatározása a DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Illumina 2013) segítségével történik.

2- A PCR-alapú KABA KAPA Library Quantification Kit-ek minden reagenst tartalmaznak, amelyek az Illumina platformokon történő szekvenálásra előkészített következő generációs szekvenálási (NGS) könyvtárak pontos, megbízható és reprodukálható qPCR-alapú kvantifikálásához szükségesek. A készletek tartalmazzák a KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix-et (különböző passzív referenciafestékekkel a különböző qPCR eszközökhöz), egy platform-specifikus könyvtári kvantifikációs primer premixet és egy előre hígított DNS-standard készletet.

A 16S rRNS gén V3-V4 régióját olyan fúziós primerekkel amplifikáljuk, amelyek Illumina adaptereket és indexelő vonalkódokat tartalmaznak. A PCR lépés hozzáadja az 1. indexet (i7) és a 2. indexet (i5), a szekvenálást és a közös adaptereket (P5 és P7), amelyek a fürtgeneráláshoz és szekvenáláshoz szükségesek. A Bioanalyzer rendszerrel nagy érzékenységű DNS-elektroforézist végeznek az NGS-könyvtár minőség-ellenőrzési elemzésének javítása érdekében. 3-16S rRNS génkönyvtár készítés és MiSeq szekvenálás. A 16S rDNS PCR-amplifikációját, a szekvenálást és az elemzéseket az NGS Illumina MiSeq végzi, amely a MiSeq Reagent Kit v3 baktérium V3V4 régióját célozza meg (600 ciklus). A 16S rRNS gén amplikon szekvenálást (16S elemzés) széles körben használják a mikrobiota elemzésére a következő generációs szekvenálási technológiákkal. 16S elemzési adatok a szabványos V3-V4 primer (V34) készletekből a hólyag mikrobiota elemzési protokolljának optimalizálására. 4- Bioinformatika és statisztikai elemzések. Az annotált genomot tovább elemzik bioinformatikai csővezetékek segítségével, hogy betekintést nyerjenek a kórokozó biológiájába és a betegséget okozó potenciálba. Magába foglalja:

- Minőségellenőrzés és a draft genom javítása hibák eltávolításával és hiánypótlással.

• A végleges genom annotációja, beleértve a gének és egyéb jellemzők funkcióinak azonosítását és leírását.
• Összehasonlító genomika, amely magában foglalja az újonnan szekvenált genom és a rokon kórokozók genomjának összehasonlítását a különbségek és hasonlóságok azonosítása érdekében.
• Funkcionális elemzés: ez magában foglalja az annotált gének funkcióinak azonosítását, valamint azon útvonalak és folyamatok megértését, amelyekben részt vesznek. Ez feltárhatja a legfontosabb virulencia-tényezőket, és segíthet megérteni a kórokozó patogenezisének mechanizmusát.
• Filogenetikai elemzés: Ez magában foglalja az újonnan szekvenált genom összehasonlítását a genom genomjával
• rokon kórokozókat az evolúciós kapcsolatok meghatározására és a kórokozók terjedésének nyomon követésére a különböző populációkban.
• Különbségek a teljes mikrobiális összetételben a hólyagrák és az egészséges között

• mintákat értékelnek. Az NGS a TBRI-ben nem érhető el, a 16S szekvenálást és a bioinformatikát az 57357-es Gyermekkórházban végzik majd (a szekvenálást "fizetett" elven várják).

  16S riboszomális RNS (rRNS) Szekvenálási analízis

  1. DNS izolálása vizeletből és szövetből. A vizeletmintákat (50 ml) felengedjük és 7500 g-vel, 4 °C-on 10 percig centrifugáljuk. A pelletet a mikrobiom DNS-tisztító készlet segítségével DNS-kivonáshoz használjuk fel. A környezetszennyezés elkerülése érdekében a vizeletmintákból és a csak reagens extrakciós kontrollból való minden izolálást PCR-fülke belsejében kell elvégezni. Az izolált DNS-mintákat -20 °C-ra helyezzük a PCR-amplifikációig. A DNS mennyiségi meghatározására assay Kit (Illumina 2013) segítségével kerül sor.
  2. A PCR alapú KABA KAPA Library Quantification Kit-ek minden reagenst tartalmaznak, amelyek az Illumina platformokon történő szekvenálásra előkészített következő generációs szekvenálási (NGS) könyvtárak pontos, megbízható és reprodukálható qPCR-alapú kvantifikálásához szükségesek. Egy platform-specifikus könyvtári kvantifikációs primer premix és egy előre hígított DNS standardkészlet.

  A 16S rRNS hipervariábilis V1V2 és V3-V4 régiókat fúziós primerekkel amplifikáljuk, amelyek Illumina adaptereket és indexelő vonalkódokat tartalmaznak.

A Bioanalyzer rendszerrel nagy érzékenységű DNS-elektroforézist végeznek az NGS-könyvtár minőség-ellenőrzési elemzésének javítása érdekében.

3-16S rRNS génkönyvtár készítés és MiSeq szekvenálás. A 16S rRNS PCR-amplifikációját, a szekvenálást és analíziseket az NGS Illumina végzi, amely a V1-V2 és V3-V4 régiót célozza meg. A 16S rRNS génamplikon szekvenálást (16S elemzés) fogják használni a mikrobiota elemzésére a következő generációs szekvenálási technológiákkal. 16S elemzési adatok a szabványos V1-V2, V3-V4 primer készletekből a hólyag mikrobiota elemzési protokolljának optimalizálásához.

4- Bioinformatika és statisztikai elemzések. Az annotált genomot tovább elemzik bioinformatikai csővezetékek segítségével, hogy betekintést nyerjenek a kórokozó biológiájába és a betegséget okozó potenciálba.

Hivatkozások

1. Bučević Popović V, Šitum M, Chow CT, Chan LS, Roje B, Terzić J. A húgyhólyagrákhoz kapcsolódó húgyúti mikrobiom. Sci Rep. 2018. augusztus 14.;8(1):12157. doi: 10.1038/s41598-018-29054-w.
2. Wishahi, M., Otto, T. & Golka, K. Re: hólyagkarcinómák neurogén hólyag- és húgyúti schistosomiasisban szenvedő betegeknél – vajon ugyanazok a daganatok?. World J Urol 40, 2139-2140 (2022). https://doi.org/10.1007/s00345-022-04076-2
3. Hanan R, Murata M, Ma N, Hammam O, Wishahi M, El Leithy T, Hiraku Y, Oikawa S, Kawanishi S (2012) A COX-2 nukleáris lokalizációja a húgyhólyagrákban a szár markereinek kifejeződésével kapcsolatban. Mediat Inflamm 2012:165879 2012;2012:165879. doi: 10.1155/2012/165879.
4. Cancrini F, Michel F, Cussenot O, Alshehhi H, Comperat E, Phé V (2022) Hólyagkarcinómák neurogén hólyag- és húgyúti schistosomiasisban szenvedő betegeknél: ugyanazok a daganatok? Világ J Urol. https://doi.org/10.1007/s00345-022-03941-4
5. Hammam O, Wishahi M, Khalil H, El Ganzouri H, Badawy M, Elkhquly A, Elesaily K (2014) A citokeratin 7, 20, 14 expressziója az egyiptomi húgyhólyagrák uroteliális karcinómájában és laphámsejtes karcinómájában. J Egypt Soc Parasitol 44(3):733-740
6. Zitvogel L, Daillère R, Roberti MP, Routy B, Kroemer G. Anticancer effects of the microbiome and its products. Nat. Rev. Microbiol. 2017;15:109-128. doi: 10.1038/nrmicro.2017.44.
7. Whiteside SA, Razvi H, Dave S, Reid G, Burton JP. A húgyúti mikrobiom – a fertőzésen túli szerep. Nat. Urol tiszteletes. 2015;12:81-90. doi: 10.1038/nrurol.2014.361.
8. Xu W és mtsai. Mini áttekintés: a mikrobiom perspektívája az uroteliális karcinóma patogenezisében. Am. J. Clin. Exp. Urol. 2014;2:57-61.
9. Brubaker, L., Gourdine, J.-P. F., Siddiqui, N. Y., Holland, A., Halverson, T., Limeria, R. és mtsai. (2021a). Konszenzus kialakítása az urobiomkutatás előmozdítása érdekében. mSystems 6, e0137120. doi: 10.1128/mSystems.01371-20
10. Brubaker, L., Putonti, C., Dong, Q. és Wolfe, A. J. (2021b). Az emberi urobióm. Mamm. Genome 32, 232-238. doi: 10.1007/s00335-021-09862-8
11. -Carrasco, V., Soriano-Lerma, A., Soriano, M., J. és Garcia-Salcedo, J. A. (2021). A húgyúti mikrobiom: a húgyúti yin és jang. Elülső. Sejt. Megfertőzni. Microbiol. 11. doi: 10.3389/fcimb.2021.617002
12. 43. Wu N, et al. A széklet mikrobiota dysbiosis aláírása vastag- és végbélrákos betegekben. Microb. Ecol. 2013;66:462-470. doi: 10.1007/s00248-013-0245-9.