Mikrobiota i urin og urothelium kan være en faktor for induktion af urinblærekræft. Undersøgelsen vil undersøge urin- og blærekræftvæv fra mandlige patienter og urin fra kontroller ved brug af hele genomiske sekventeringsteknikker og 16S rRNA. Målet er at belyse mikrobiotas rolle i blæren (Cancer bladder)

-Rationelt og mål:

A- Blærekræft:

Begrundelse Blærekræft anslås at være den niende hyppigste maligne sygdom, med 160.000 eller flere dødsfald om året estimeret globalt.

Der er en stigende bevidsthed om den vigtige rolle, som mikrober, der lever i urinvejene, spiller en vigtig rolle i opretholdelse af sundhed og udvikling af sygdomme og blærekræft [1].

Der er en veletableret sammenhæng mellem initiering af blærekræft og specifikke mikrobielle midler [2,3,4,5,].

Beskadigelse af værts-DNA'et kunne initieres direkte via genotoksiner produceret af specifikke E. coli-stammer eller via en indirekte vej ved at initiere oxidative arter. Microbiome og dets produkter har en anticancer-effekt [6].

Traditionelt er urin og blæreurothelium blevet betragtet som sterile hos raske individer. Dette koncept var baseret på standard mikrobiologiske urinkulturer. For nylig er der kumulerede beviser og beviser for, at urinvejene også huser forskellige kommensale mikroorganismer. Urinmikrobiomet er blevet rapporteret hos raske personer [7].

Urinmikrobiomet i blærekræft er sjældent blevet undersøgt, det var blevet rapporteret, at Streptococcus sp var beriget i blæren hos nogle patienter med blærekræft [8].

Bučević Popović V et al [1] rapporterede, at: "Bakteriesamfund til stede i urinprøver fra mandlige patienter med blærekræft og fra raske individer blev analyseret ved hjælp af 16S-sekventering. Resultaterne viser, at den mest udbredte phylum i begge grupper var Firmicutes, efterfulgt af Actinobacteria, Bacteroidetes og Proteobacteria. Betydeligt beriget i blærekræft var slægten Fusobacterium, som er et muligt protumorigent patogen. I blærekræftvæv var Fusobacterium nucleatum-sekvenser påvist ved PCR, slægterne Veillonella, Streptococcus og Corynebacterium, mere rigelige i sunde uriner. Campylobacter hominis blev beriget i urinprøver fra patienter med blærekræft, Campylobacter-arter er potentielt patogene, da de producerer toksiner, invaderer epitelceller og kan undgå værtsimmunresponser".

Mikrobiota kan give tumor-undertrykkende virkninger til den menneskelige vært [6]. Næste generations sekvenseringsteknologier (NGS) har muliggjort profilering af mikrobielle samfund i specifikke habitater. 16S ribosomalt RNA (rRNA) gensekventering bruges til mikrobiotaprofilering med NGS-teknologier. Det er vigtigt at vælge, hvilken 16S rRNA hypervariabel region, der skal sekvenseres, i mikrobiotaprofileringsundersøgelser. Alle ni 16S rRNA hypervariable regioner er taksonomisk informative, men på grund af variation i profileringsydelse for specifikt, vil valget af den ideelle 16S rRNA hypervariable region afhænge af bakteriesammensætningen af ​​det habitat, der undersøges. Mikrobielle samfund, der koloniserer urinvejene (urobiomet), identificeres i V4,V5. Nylige undersøgelser har vist, at urobiom dysbiose er forbundet med flere urologiske tilstande [9,10,11] og blærekræft [12].

Mål: Derfor er det afgørende at karakterisere urobiomet i sundhed og blærekræft, og kan føre til nye forebyggelses-, diagnose- og behandlingsstrategier for blærekræft.

Formål Formålet med denne forskningsundersøgelse er at karakterisere urinmikrobiotaen hos voksne mandlige patienter med blærekræft og at blive korreleret med mikrobiota hos raske voksne mænds kontroller.

2-Metode 2-1 Undersøgelsestype: Prospektiv casekontrolstudie 2-2 Inklusion, eksklusionskriterier, rekrutteringsproces. [inkluderede patienter i undersøgelsen vil blive bedt om at give et informeret samtykke, Dr. Loay Mostafa og Dr. Mohamed Sahab fra Urologisk Afdeling - TBRI vil være ansvarlige for dette punkt].

Inklusionskriterier:

• Voksne mænd over 18 år,
• Diagnosticeret for carcinom i blæren med billeddiagnostisk ultralyd og/eller computertomografi og urincytologi.
• Bekræftet blærekræft enten under diagnostisk cystoskopi, tidligere patologi eller patologisk undersøgelse af biopsiprøverne.

Ekskluderingskriterier:

• Tidligere strålebehandling til blæren eller til tilstødende organ.
• Tidligere intravesikal instillation af immunterapi med bacillus Calmette-Guérin (BCG), eller intravesikal instillation af kemoterapeutika.
• Tidligere neoadjuverende kemoterapi. Rekrutteringsproces Patienter, der opfylder eksklusions- og inklusionskriterierne. 2-3 Prøvestørrelse Tredive egyptiske mænd, alder ≥ 18 år, vil blive rekrutteret ved Urologiafdelingen, TBRI i henhold til prøvestørrelsesberegning ved hjælp af onlinesoftware (Sample Size Calculator). Ti urinprøver vil blive indsamlet fra normale individer.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html Prøvestørrelsen vil være 16 for ikke-muskelinvasiv blærekræft (NMIBC). Det betyder, at 16 eller flere målinger/undersøgelser er nødvendige for at have et konfidensniveau på 95 %. Prøvestørrelsen vil være 11 for muskelinvasiv blærekræft (MIBC). Det betyder, at 40 eller flere målinger/undersøgelser er nødvendige for at have et konfidensniveau på 95 %. Prøvestørrelsen vil være 11 for kontrolgruppen. Det betyder, at 10 eller flere målinger/undersøgelser er nødvendige for at have et konfidensniveau på 95 % A. 38 mænd vil blive rekrutteret på Urologisk Afdeling, TBRI. Ifølge prøvestørrelsesberegning ved hjælp af onlinesoftware (Sample Size Calculator). Elleve urinprøver vil blive indsamlet fra Prøvestørrelse vil være 16 for ikke-muskelinvasiv blærekræft (NMIBC). Det betyder, at 16 eller flere målinger/undersøgelser er nødvendige for at have et konfidensniveau på 95 % for, at den reelle værdi er inden for ±17,53 % af den målte/undersøgte værdi.

Prøvestørrelsen vil være 11 for muskelinvasiv blærekræft (MIBC). Det betyder, at 11 eller flere målinger/undersøgelser er nødvendige for at have et konfidensniveau på 95 % for, at den reelle værdi er inden for ±30,36 % af den målte/undersøgte værdi.

Prøvestørrelsen vil være 11 for kontrolgruppen. Det betyder, at 11 eller flere målinger/undersøgelser er nødvendige for at have et konfidensniveau på 95 % for, at den reelle værdi er inden for ±30,36 % af den målte/undersøgte værdi.

normale individer. Denne prøve repræsenterer forskningen i mikrobiom i blærekræft.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Prøvesamling

Blærekræft:

Det samlede antal undersøgte prøver: Undersøgelsen vil udforske mikrobiotaen i urin og i vævsprøver, så hver patient med blærekræft vil give (2 prøver). Kontrolgruppen vil give urinprøve (en prøve). Nyere forskning viste, at mikrobiota er påvist i urothelium hos normale individer og patienter med blærekræft, denne mikrobiota ville adskille sig fra urin(flydende) mikrobiota.

Referencer:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Blærekræftrelateret mikrobiota: undersøgelse af forskelle i urin- og vævsprøver. Sci Rep. 2020 Jul 6;10(1):11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Profilering af blæremikrobiotaen hos patienter med blærekræft. Front Microbiol. 7. februar 2022; 12:718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   Gruppe I: Ikke-muskelinvasiv blærekræft, 16 patienter, 16 til blærevæv og 16 til urinprøver. I alt 32 prøver. (Undersøgelsen vil udforske mikrobiotaen i urin og i vævsprøver, så hver patient med blærekræft vil give (2 prøver). Kontrolgruppen vil give urinprøve (en prøve). Nyere forskning viste, at mikrobiota påvises i urothelium hos normale individer og patienter med blærekræft, denne mikrobiota ville adskille sig fra urin(flydende) mikrobiota.(Referencer: ) Gruppe II: Muskelinvasiv blærekræft, 11 patienter. 22 prøver 11 til blærevæv og 11 til urinprøver fra de samme patienter. Gruppe III: 11 Normale voksne: urinprøver fra tjener som kontrolgruppe for undersøgelsen.

   Samlet antal deltagere er 38 individuelle.

   Prøver til mikrobiomanalyse:

   Prøver vil blive indsamlet i rene lækagetætte beholdere uden rester af desinfektionsmiddel eller rengøringsmidler og med tætsluttende lækagesikre låg og opbevaret i køleskab, indtil de analyseres på TBRI's mikrobiologiske laboratorium.

   Urinprøver (50 ml) til mikrobiomanalyse vil blive indsamlet under cystoskopiundersøgelse. Prøver vil blive opbevaret ved -80 °C indtil behandling.

   Vævs- og urinprøver fra patienter med blærekræft: Under standardprocedure for diagnostisk cystoskopi vil urinprøve blive indsamlet under fuldstændige aseptiske forhold, patienter med blæretumor vil gennemgå transurethral resektion af blæretumor, en vævsprøve på 0,5x0,5 cm vil blive undersøgt til mikrobiomanalyse. Prøver vil blive opbevaret ved -80 °C indtil behandling. Histopatologisk diagnose med hæmatoxylin og eosin-farvning vil blive udført af en ekspert patolog for tumorgrad og stadium i henhold til WHO 22 og EAU retningslinjer 2023. Denne procedure vil blive anvendt til både ikke-muskelinvasivt og muskelinvasivt urotelialt karcinom. Patienter, der skal gennemgå radikal cystektomi for blærekræft, vil blive inkluderet i prøvestørrelsen.

   Prøver til patologiske undersøgelser:

   Vævsprøver fikseres med formalin og undersøges med hæmatoxylin og eosinfarvning.

   Klinisk information Urologerne vil give tilstrækkelige vævsprøver, som er en lille del af hele den resekerede tumor eller en del af cystektomiprøver. til patologisk evaluering med at give nyttig klinisk information til patologen for at beslutte den bedste tilgang til håndtering og behandling af de kirurgiske prøver og udarbejde en nøjagtig patologirapport.

   Urologen vil specificere:

   • Demografiske data og patientens kliniske historie, anamnese med urinvejsinfektion, og hvis den var tilbagevendende eller sporadisk, blærecytologi, hvis tilstede, om det er den første præsentation af tumoren og hvis ikke, detaljer om tidligere behandling.
   • Det cystoskopiske udseende af blæreslimhinden og angive antal, størrelse, placering af tumoren/svulstene, de morfologiske træk ved læsionen: papillær, fast eller ulcerat.
   • Tilstanden af ​​resterende slimhinde, hvis yderligere biopsier blev udført.

   Disse oplysninger er nødvendige for en korrekt vurdering af urothelium og søgning i mikrobiom. Fordi behandlingerne kan have indflydelse på tumormorfologi og på normalt udseende urothelium.

   Indberetning af blærekræftprøver

   • Patologisk vurdering Patologen vil diagnosticere, om der er blærekræft og typen af ​​blærekræft, ved at undersøge celler fra blærevævsbiopsien. Forskellige histologiske tumortyper af blærekræft vil blive rapporteret i henhold til 2016 WHO-klassifikationen af ​​urinblæretumorer (Mazzucchelli et al. 2021), modificeret i 2022.
   • Mikrobiologisk vurdering: Mikrobielle identifikationsmetoder fra Urin og væv

   Prøveindsamling og dyrkningsbetingelser for kliniske bakterieisolater:

   Påvisning af et begrænset antal mikroorganismer, hovedsageligt aerobe og hurtigtvoksende bakterier.

   Identifikation af bakterielle isolater: Isolaterne vil blive identificeret ved dyrkning på blod, MacConkey-agar og sabaruds-agar og vil derefter blive identificeret ved at udføre biokemiske tests, oxidase-test mannitol, galde esculin og katalase test. Alle isolater vil blive identificeret på artsniveau ved at bruge Vitek 2 kompakt system.

   2-5 Biokemi og molekylærbiologisk vurdering: 16S Metagenomic Sequencing analyse Helgenomisk sekventering (WGS) vil blive anvendt på alle tilfælde, metodologi og kvalitetskontrol er i henhold til det genomiske og metagenomiske center på børnekræfthospitalet 57357, der skal udføre WGS- og 16S-sekventering på urin- og vævsprøver.

1- DNA-isolering fra urin og væv. Urinprøver (50 ml) vil blive optøet og centrifugeret ved 7500g, 4°C i 10 minutter. Pelleten vil blive brugt til DNA-ekstraktion ved hjælp af Invitrogen™ PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit, udført i henhold til producentens protokol. For at undgå miljøforurening vil alle isoleringer fra urinprøver og fra ekstraktionskontrollen udelukkende for reagens blive udført i en PCR-hætte. Isolerede DNA-prøver vil blive placeret ved -20 °C indtil PCR-amplifkation. DNA vil blive kvantificeret ved hjælp af DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Illumina 2013).

2- PCR-baserede KABA KAPA Library Quantification Kits indeholder alle de reagenser, der er nødvendige for den nøjagtige, pålidelige og reproducerbare qPCR-baserede kvantificering af næste generations sekventeringsbiblioteker (NGS) forberedt til sekventering på Illumina-platforme. Kits inkluderer KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (formuleret med forskellige passive referencefarvestoffer til forskellige qPCR-instrumenter), et platformsspecifikt bibliotekskvantificeringsprimer-premix og et forudfortyndet sæt DNA-standarder.

16S rRNA-genets V3-V4-region vil blive forstærket med fusionsprimere, der inkorporerer Illumina-adaptere og indekserende stregkoder. PCR-trinnet tilføjer indeks 1 (i7) og indeks 2 (i5), sekventering og fælles adaptere (P5 og P7), der kræves til klyngegenerering og sekventering. Højfølsom DNA-elektroforese med Bioanalyzer-systemet vil blive udført for at forbedre kvalitetskontrolanalysen af ​​NGS-biblioteket. 3- 16S rRNA genbibliotek forberedelse og MiSeq sekventering. PCR-amplifikation af 16S rDNA, sekventering og analyser vil blive udført af NGS Illumina MiSeq målrettet mod V3V4-regionen af ​​bakterier MiSeq Reagent Kit v3 (600-cyklus). 16S rRNA gen amplikon sekventering (16S analyse) bruges i vid udstrækning til at analysere mikrobiota med næste generations sekventeringsteknologier. 16S-analysedata fra standard V3-V4-primersættene (V34) for at optimere blæremikrobiotaanalyseprotokollen. 4- Bioinformatik og statistiske analyser. Det annoterede genom analyseres yderligere ved hjælp af bioinformatiske pipelines for at få indsigt i patogenets biologi og potentiale for at forårsage sygdom. Det omfatter:

- Kvalitetskontrol og forbedring af udkastet til genom ved at fjerne fejl og udfylde huller.

• Annotering af det endelige genom, herunder identifikation og beskrivelse af funktionerne af gener og andre egenskaber.
• Komparativ genomik, som involverer sammenligning af det nyligt sekventerede genom med dem fra beslægtede patogener for at identificere forskelle og ligheder.
• Funktionel analyse: dette involverer at identificere funktionerne af de kommenterede gener og forstå de veje og processer, de deltager i. Dette kan afsløre vigtige virulensfaktorer og hjælpe med at forstå patogenets patogenesemekanisme.
• Fylogenetisk analyse: Dette indebærer at sammenligne det nyligt sekventerede genom med dem fra
• relaterede patogener for at bestemme evolutionære forhold og spore spredningen af ​​patogener i forskellige populationer.
• Forskelle i den overordnede mikrobielle sammensætning mellem blærekræft og rask

• prøver vil blive vurderet. NGS er ikke tilgængelig i TBRI, 16S-sekventering og bioinformatik vil blive udført betalt på børnehospitalet 57357 (de er velkomne til at udføre sekventeringen efter et "betalt"-princip).

  16S ribosomalt RNA (rRNA) sekventeringsanalyse

  1. DNA-isolering fra urin og væv. Urinprøver (50 ml) vil blive optøet og centrifugeret ved 7500g, 4°C i 10 minutter. Pelleten vil blive brugt til DNA-ekstraktion ved hjælp af mikrobiom DNA-oprensningskit. For at undgå miljøforurening vil alle isoleringer fra urinprøver og fra ekstraktionskontrollen udelukkende for reagens blive udført i en PCR-hætte. Isolerede DNA-prøver vil blive placeret ved -20 °C indtil PCR-amplifikation. DNA vil blive kvantificeret ved hjælp af et assay-kit (Illumina 2013).
  2. PCR-baserede KABA KAPA Library Quantification Kits indeholder alle de reagenser, der er nødvendige for den nøjagtige, pålidelige og reproducerbare qPCR-baserede kvantificering af næste-generations sekventeringsbiblioteker (NGS) forberedt til sekventering på Illumina-platforme. Et platformsspecifikt bibliotekskvantificeringsprimerpræmix og et forfortyndet sæt DNA-standarder.

  16S rRNA hypervariable regioner V1V2 og V3-V4 regioner vil blive forstærket med fusionsprimere, der inkorporerer Illumina adaptere og indekserende stregkoder.

Højfølsom DNA-elektroforese med Bioanalyzer-systemet vil blive udført for at forbedre kvalitetskontrolanalysen af ​​NGS-biblioteket.

3- 16S rRNA genbibliotek forberedelse og MiSeq sekventering. PCR-amplifikation af 16S rRNA, sekventering og analyser vil blive udført af NGS Illumina målrettet mod V1-V2 og V3-V4 region. 16S rRNA gen amplikon sekventering (16S analyse) vil blive brugt til at analysere mikrobiota med næste generations sekventeringsteknologier. 16S-analysedata fra standard V1-V2, V3-V4 primersæt for at optimere blæremikrobiotaanalyseprotokollen.

4- Bioinformatik og statistiske analyser. Det annoterede genom analyseres yderligere ved hjælp af bioinformatiske pipelines for at få indsigt i patogenets biologi og potentiale for at forårsage sygdom.

Referencer

1. Bučević Popović V, Šitum M, Chow CT, Chan LS, Roje B, Terzić J. Urinmikrobiom forbundet med blærekræft. Sci Rep. 2018 Aug 14;8(1):12157. doi: 10.1038/s41598-018-29054-w.
2. Wishahi, M., Otto, T. & Golka, K. Re: blærekarcinomer hos patienter med neurogen blære- og urinschistosomiasis - er de de samme tumorer?. World J Urol 40, 2139-2140 (2022). https://doi.org/10.1007/s00345-022-04076-2
3. Hanan R, Murata M, Ma N, Hammam O, Wishahi M, El Leithy T, Hiraku Y, Oikawa S, Kawanishi S (2012) Nuklear lokalisering af COX-2 i forhold til ekspressionen af ​​stamnessmarkører i urinblærekræft. Mediat Inflamm 2012:165879 2012;2012:165879. doi: 10.1155/2012/165879.
4. Cancrini F, Michel F, Cussenot O, Alshehhi H, Comperat E, Phé V (2022) Blærekarcinomer hos patienter med neurogen blære og urinskistosomiasis: er de de samme tumorer? Verden J Urol. https://doi.org/10.1007/s00345-022-03941-4
5. Hammam O, Wishahi M, Khalil H, El Ganzouri H, Badawy M, Elkhquly A, Elesaily K (2014) Ekspression af cytokeratin 7, 20, 14 i urothelial carcinom og pladecellecarcinom af den egyptiske urinblærekræft. J Egypt Soc Parasitol 44(3):733-740
6. Zitvogel L, Daillère R, Roberti MP, Routy B, Kroemer G. Anticancervirkninger af mikrobiomet og dets produkter. Nat. Rev. Microbiol. 2017;15:109-128. doi: 10.1038/nrmicro.2017.44.
7. Whiteside SA, Razvi H, Dave S, Reid G, Burton JP. Mikrobiomet i urinvejene - en rolle ud over infektion. Nat. Rev. Urol. 2015;12:81-90. doi: 10.1038/nrurol.2014.361.
8. Xu W, et al. Mini-review: perspektiv af mikrobiomet i patogenesen af ​​urotelialt karcinom. Er. J. Clin. Exp. Urol. 2014;2:57-61.
9. Brubaker, L., Gourdine, J.-P. F., Siddiqui, N. Y., Holland, A., Halverson, T., Limeria, R., et al. (2021a). Dannelse af konsensus for at fremme urobiomforskning. mSystems 6, e0137120. doi: 10.1128/mSystems.01371-20
10. Brubaker, L., Putonti, C., Dong, Q. og Wolfe, A. J. (2021b). Det menneskelige urobiom. Mamma. Genome 32, 232-238. doi: 10.1007/s00335-021-09862-8
11. -Carrasco, V., Soriano-Lerma, A., Soriano, M., J. og Garcia-Salcedo, J.A. (2021). Urinmikrobiom: Yin og Yang i urinvejene. Foran. Celle. Inficere. Microbiol. 11. doi: 10.3389/fcimb.2021.617002
12. 43. Wu N, et al. Dysbiose signatur af fækal mikrobiota hos kolorektal cancerpatienter. Microb. Ecol. 2013;66:462-470. doi: 10.1007/s00248-013-0245-9.