Mikrobiota i urin og urothelium kan være en faktor for induksjon av urinblærekreft. Studien vil undersøke urin- og blærekreftvev fra mannlige pasienter og urin fra kontroller ved bruk av hele genomiske sekvenseringsteknikker og 16S rRNA. Målet er å belyse rollen til mikrobiota i blæren (Cancer bladder)

-Rasjonelt og mål:

A- Blærekreft:

Begrunnelse Blærekreft anslås å være den niende hyppigste ondartede sykdommen, med 160 000 eller flere dødsfall per år estimert globalt.

Det er en stadig større bevissthet om den viktige rollen til mikrober som lever i urinveiene som spiller en viktig rolle i vedlikehold av helse og utvikling av sykdommer og blærekreft [1].

Det er en veletablert sammenheng mellom initiering av blærekreft og spesifikke mikrobielle midler [2,3,4,5,].

Skade på verts-DNA kan initieres direkte via genotoksiner produsert av spesifikke E. coli-stammer eller via en indirekte rute ved å initiere oksidative arter. Microbiome og dets produkter har en antikrefteffekt [6].

Tradisjonelt har urin og blære urotel blitt ansett som sterile hos friske individer. Dette konseptet var basert på standard mikrobiologiske urinkulturer. Nylig er det kumulerende bevis og bevis for at urinveiene også huser distinkte kommensale mikroorganismer. Urinmikrobiomet er rapportert hos friske individer [7].

Urinmikrobiomet i blærekreft har blitt undersøkt sjelden, det hadde blitt rapportert at Streptococcus sp ble beriket i blæren til noen pasienter med blærekreft [8].

Bučević Popović V et al [1] rapporterte at: "Bakteriesamfunn tilstede i urinprøver fra mannlige pasienter med blærekreft, og fra friske individer ble analysert ved hjelp av 16S-sekvensering. Resultatene viser at den hyppigst forekommende phylum i begge grupper var Firmicutes, etterfulgt av Actinobacteria, Bacteroidetes og Proteobacteria. Betydelig beriket i blærekreft var slekten Fusobacterium, som er et mulig protumorigent patogen. I blærekreftvev var Fusobacterium nucleatum-sekvenser påvist ved PCR, slektene Veillonella, Streptococcus og Corynebacterium, mer tallrike i friske uriner. Campylobacter hominis ble beriket i urinprøver fra pasienter med blærekreft, Campylobacter-arter er potensielt patogene da de produserer toksiner, invaderer epitelceller og kan unngå vertsimmunresponser".

Mikrobiota kan gi tumor-undertrykkende effekter til den menneskelige verten [6]. Neste generasjons sekvenseringsteknologi (NGS) har muliggjort profilering av mikrobielle samfunn i spesifikke habitater. 16S ribosomalt RNA (rRNA) gensekvensering brukes til mikrobiotaprofilering med NGS-teknologier. Å velge hvilken 16S rRNA hypervariabel region som skal sekvenseres er avgjørende i mikrobiotaprofileringsstudier er viktig. Alle de ni 16S rRNA hypervariable regionene er taksonomisk informative, men på grunn av variasjon i profileringsytelse for spesifikt, vil valg av den ideelle 16S rRNA hypervariable regionen avhenge av bakteriesammensetningen til habitatet som studeres. Mikrobielle samfunn som koloniserer urinveiene (urobiomet) er identifisert i V4,V5. Nyere studier har vist at urobiom dysbiose er knyttet til flere urologiske tilstander [9,10,11], og blærekreft [12].

Mål: Derfor er det avgjørende å karakterisere urobiomet ved helse og blærekreft, og kan føre til nye forebyggings-, diagnose- og behandlingsstrategier for blærekreft.

Mål Målet med denne forskningsstudien er å karakterisere urinmikrobiotaen til voksne mannlige pasienter med blærekreft og å være korrelert med mikrobiota hos friske voksne mannlige kontroller.

2-Metode 2-1 Studietype: Prospektiv casekontrollstudie 2-2 Inkludering, eksklusjonskriterier, rekrutteringsprosess. [inkluderte pasienter i studien vil bli bedt om å gi et informert samtykke, Dr. Loay Mostafa og Dr. Mohamed Sahab fra urologisk avdeling - TBRI vil være ansvarlig for dette elementet].

Inklusjonskriterier:

• Voksne menn over 18 år,
• Diagnostisert av karsinom i blæren med ultrasonografi og/eller datatomografi og urincytologi.
• Bekreftet blærekreft enten under diagnostisk cystoskopi, tidligere patologi eller patologisk undersøkelse av biopsiprøvene.

Ekskluderingskriterier:

• Tidligere strålebehandling til blæren eller til tilstøtende organ.
• Tidligere intravesikal instillasjon av immunterapi med bacillus Calmette-Guérin (BCG), eller intravesikal instillasjon av kjemoterapeutika.
• Tidligere neoadjuvant kjemoterapi. Rekrutteringsprosess Pasienter som oppfyller eksklusjons- og inkluderingskriteriene. 2-3 Prøvestørrelse Trettiåtte egyptiske menn, alder ≥ 18 år, vil bli rekruttert ved Institutt for urologi, TBRI i henhold til prøvestørrelsesberegning ved bruk av nettbasert programvare (Sample Size Calculator). Ti urinprøver vil bli tatt fra normale individer.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html Prøvestørrelse vil være 16 for ikke-muskelinvasiv blærekreft (NMIBC). Dette betyr at 16 eller flere målinger/undersøkelser er nødvendig for å ha et konfidensnivå på 95 %. Prøvestørrelse vil være 11 for muskelinvasiv blærekreft (MIBC). Dette betyr at 40 eller flere målinger/undersøkelser er nødvendig for å ha et konfidensnivå på 95 %. Prøvestørrelse vil være 11 for kontrollgruppen. Dette betyr at 10 eller flere målinger/undersøkelser er nødvendig for å ha et konfidensnivå på 95 % A. 38 menn vil bli rekruttert ved Urologisk avdeling, TBRI. I henhold til prøvestørrelsesberegning ved bruk av online programvare (Sample Size Calculator). Elleve urinprøver vil bli samlet fra Prøvestørrelse vil være 16 for ikke-muskelinvasiv blærekreft (NMIBC). Dette betyr at det trengs 16 eller flere målinger/undersøkelser for å ha et konfidensnivå på 95 % for at den virkelige verdien er innenfor ±17,53 % av den målte/undersøkte verdien.

Prøvestørrelse vil være 11 for muskelinvasiv blærekreft (MIBC). Dette betyr at det trengs 11 eller flere målinger/undersøkelser for å ha et konfidensnivå på 95 % for at den virkelige verdien er innenfor ±30,36 % av den målte/undersøkte verdien.

Prøvestørrelse vil være 11 for kontrollgruppen. Dette betyr at det trengs 11 eller flere målinger/undersøkelser for å ha et konfidensnivå på 95 % for at den virkelige verdien er innenfor ±30,36 % av den målte/undersøkte verdien.

normale individer. Denne prøven representerer forskningen på mikrobiom i blærekreft.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Prøvesamling

Blærekreft:

Totalt antall studerte prøver: Studien vil utforske mikrobiotaen i urin og i vevsprøver, slik at hver pasient med blærekreft vil gi (2 prøver). Kontrollgruppen vil gi urinprøve (en prøve). Nyere forskning viste at mikrobiota er påvist i urotelet til normale individer og pasienter med blærekreft, denne mikrobiotaen vil skille seg fra urin(flytende) mikrobiota.

Referanser:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Blærekreftrelatert mikrobiota: undersøkelse av forskjeller i urin- og vevsprøver. Sci Rep. 2020 6. juli;10(1):11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Profilering av blæremikrobiota hos pasienter med blærekreft. Front Microbiol. 7. februar 2022; 12:718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   Gruppe I: Ikke-muskelinvasiv blærekreft, 16 pasienter, 16 for blærevev og 16 for urinprøver. Totalt 32 prøver. (Studien vil utforske mikrobiotaen i urin og i vevsprøver, så hver pasient med blærekreft vil gi (2 prøver). Kontrollgruppen vil gi urinprøve (en prøve). Nyere forskning viste at mikrobiota er påvist i urotelet til normale individer og pasienter med blærekreft, denne mikrobiotaen vil skille seg fra urin(flytende) mikrobiota.(Referanser: ) Gruppe II: Muskelinvasiv blærekreft, 11 pasienter. 22 prøver 11 for blærevev og 11 for urinprøver hentet fra samme pasienter. Gruppe III: 11 Normale voksne: urinprøver fra fungerer som kontrollgruppe for studien.

   Totalt antall deltakere er 38 individuelle.

   Prøver for mikrobiomanalyse:

   Prøver samles i rene lekkasjesikre beholdere uten rester av desinfeksjonsmiddel eller vaskemiddel og med tettsittende lekkasjesikre lokk og oppbevares i kjøleskap til de analyseres ved TBRIs mikrobiologiske laboratorium.

   Urinprøver (50 ml) for mikrobiomanalyse vil bli samlet inn under cystoskopiundersøkelse. Prøver vil bli lagret ved -80 °C frem til behandling.

   Vevs- og urinprøver fra pasienter med blærekreft: Under standard prosedyre for diagnostisk cystoskopi vil urinprøve bli tatt under fullstendige aseptiske forhold, pasienter som har blæresvulst vil gjennomgå transuretral reseksjon av blæretumor, en vevsprøve på 0,5x0,5 cm vil bli undersøkt for mikrobiomanalyse. Prøver vil bli lagret ved -80 °C frem til behandling. Histopatologisk diagnose med Hematoxylin og eosinfarging vil bli gjort av en ekspert patolog for tumorgrad og stadium i henhold til WHO 22, og EAU retningslinjer 2023. Denne prosedyren vil bli brukt for både ikke-muskelinvasivt og muskelinvasivt urotelialt karsinom. Pasienter som skal gjennomgå radikal cystektomi for blærekreft vil bli inkludert i prøvestørrelsen.

   Prøver for patologiske studier:

   Vevsprøver vil bli fikset med formalin og undersøkt med hematoksylin og eosinfarging.

   Klinisk informasjon Urologene vil gi tilstrekkelige vevsprøver som er en liten del av hele den resekerte svulsten eller en del av cystektomiprøver. for patologisk evaluering med å gi nyttig klinisk informasjon til patologen for å bestemme den beste tilnærmingen til håndtering og behandling av kirurgiske prøver og utarbeide en nøyaktig patologirapport.

   Urologen vil spesifisere:

   • Demografiske data og klinisk historie til pasienten, historie med urinveisinfeksjon og hvis den var tilbakevendende eller sporadisk, blærecytologi hvis tilstede, enten det er den første presentasjonen av svulsten og hvis ikke, detaljer om tidligere behandling.
   • Det cystoskopiske utseendet til blæreslimhinnen og indikerer antall, størrelse, plassering av svulsten/svulstene, de morfologiske egenskapene til lesjonen: papillær, solid eller ulcerat.
   • Tilstanden til gjenværende slimhinne hvis ytterligere biopsier ble utført.

   Disse opplysningene er nødvendige for en korrekt vurdering av urotel og søk i mikrobiom. Fordi behandlingene kan ha innvirkning på tumormorfologi og på normalt utseende urotel.

   Rapportering av blærekreftprøver

   • Patologisk vurdering Patologen vil diagnostisere om en blærekreft er tilstede og hvilken type blærekreft, ved å undersøke celler fra blærevevsbiopsien. Ulike histologiske tumortyper av blærekreft vil bli rapportert i henhold til 2016 WHO-klassifiseringen av urinblæresvulster (Mazzucchelli et al. 2021), modifisert i 2022.
   • Mikrobiologisk vurdering: Mikrobielle identifikasjonsmetoder fra Urin og vev

   Prøveinnsamling og dyrkingsbetingelser for kliniske bakterieisolater:

   Påvisning av et begrenset antall mikroorganismer, hovedsakelig aerobe og hurtigvoksende bakterier.

   Identifikasjon av bakterieisolater: Isolatene vil bli identifisert ved dyrking på blod, MacConkey-agar og sabaruds-agar, og vil deretter bli identifisert ved å utføre biokjemiske tester, oksidasetest mannitol, galleesculin og katalasetest. Alle isolater vil bli identifisert til artsnivå ved å bruke Vitek 2 kompaktsystem.

   2-5 Biokjemi og molekylærbiologisk vurdering: 16S Metagenomic Sequencing analyse Helgenomisk sekvensering (WGS) vil bli brukt på alle tilfeller, metodikk og kvalitetskontroll er i henhold til genomisk og metagenomisk senter i barnekreftsykehuset 57357 som skal utføre WGS- og 16S-sekvensering på urin- og vevsprøver.

1- DNA-isolering fra urin og vev. Urinprøver (50 ml) vil bli tint og sentrifugert ved 7500g, 4°C i 10 minutter. Pelleten vil bli brukt til DNA-ekstraksjon ved bruk av Invitrogen™ PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit, utført i henhold til produsentens protokoll. For å unngå miljøforurensning, vil alle isoleringer fra urinprøver og fra ekstraksjonskontrollen kun for reagens bli utført i en PCR-hette. Isolerte DNA-prøver vil bli plassert ved -20 °C frem til PCR-amplifisering. DNA vil kvantifiseres ved hjelp av DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Illumina 2013).

2- PCR-baserte KABA KAPA bibliotekkvantifiseringssett inneholder alle reagensene som trengs for nøyaktig, pålitelig og reproduserbar qPCR-basert kvantifisering av neste generasjons sekvenseringsbibliotek (NGS) forberedt for sekvensering på Illumina-plattformer. Settene inkluderer KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (formulert med forskjellige passive referansefargestoffer for forskjellige qPCR-instrumenter), en plattformspesifikk bibliotekkvantifiseringsprimer-premix og et forhåndsfortynnet sett med DNA-standarder.

16S rRNA-genet V3-V4-regionen vil bli forsterket med fusjonsprimere som inkorporerer Illumina-adaptere og indekserende strekkoder. PCR-trinnet legger til indeks 1 (i7) og indeks 2 (i5), sekvensering og vanlige adaptere (P5 og P7) som kreves for klyngegenerering og sekvensering. Høysensitiv DNA-elektroforese med Bioanalyzer-systemet vil bli gjort for å forbedre kvalitetskontrollanalysen av NGS-biblioteket. 3- 16S rRNA genbibliotek forberedelse og MiSeq sekvensering. PCR-amplifisering av 16S rDNA, sekvensering og analyser vil bli utført av NGS Illumina MiSeq målrettet mot V3V4-regionen av bakterier MiSeq Reagent Kit v3 (600-syklus). 16S rRNA-genamplikonsekvensering (16S-analyse) er mye brukt for å analysere mikrobiota med neste generasjons sekvenseringsteknologier. 16S-analysedata fra standard V3-V4-primersett (V34) for å optimalisere blæremikrobiotaanalyseprotokollen. 4- Bioinformatikk og statistiske analyser. Det kommenterte genomet analyseres videre ved hjelp av bioinformatiske rørledninger for å få innsikt i patogenets biologi og potensiale for å forårsake sykdom. Det inkluderer:

- Kvalitetskontroll og forbedring av utkastet genom ved å fjerne feil og fylle ut hull.

• Annotering av det endelige genomet, inkludert identifisering og beskrivelse av funksjonene til gener og andre funksjoner.
• Komparativ genomikk, som innebærer å sammenligne det nylig sekvenserte genomet med det til beslektede patogener for å identifisere forskjeller og likheter.
• Funksjonell analyse: Dette innebærer å identifisere funksjonene til de kommenterte genene og forstå veiene og prosessene de deltar i. Dette kan avsløre viktige virulensfaktorer og bidra til å forstå patogenets patogenesemekanisme.
• Fylogenetisk analyse: Dette innebærer å sammenligne det nylig sekvenserte genomet med det til
• relaterte patogener for å bestemme evolusjonære forhold og spore spredningen av patogener i forskjellige populasjoner.
• Forskjeller i den totale mikrobielle sammensetningen mellom blærekreft og frisk

• prøver vil bli vurdert. NGS er ikke tilgjengelig i TBRI, 16S sekvensering og bioinformatikk vil bli gjort betalt i Children Hospital 57357 (de er velkommen til å utføre sekvenseringen på et "betalt" prinsipp).

  16S ribosomalt RNA (rRNA) Sekvenseringsanalyse

  1. DNA-isolering fra urin og vev. Urinprøver (50 ml) vil bli tint og sentrifugert ved 7500g, 4°C i 10 minutter. Pelleten vil bli brukt til DNA-ekstraksjon ved bruk av mikrobiom DNA Purification Kit. For å unngå miljøforurensning, vil alle isoleringer fra urinprøver og fra ekstraksjonskontrollen kun for reagens bli utført i en PCR-hette. Isolerte DNA-prøver vil bli plassert ved -20 °C frem til PCR-amplifisering. DNA vil bli kvantifisert ved hjelp av et analysesett (Illumina 2013).
  2. PCR-baserte KABA KAPA bibliotekkvantifiseringssett inneholder alle reagensene som trengs for nøyaktig, pålitelig og reproduserbar qPCR-basert kvantifisering av neste generasjons sekvenseringsbibliotek (NGS) forberedt for sekvensering på Illumina-plattformer. En plattformspesifikk bibliotekkvantifiseringsprimerpremiks og et forhåndsfortynnet sett med DNA-standarder.

  16S rRNA hypervariable regioner V1V2 og V3-V4 regioner vil bli forsterket med fusjonsprimere som inkorporerer Illumina-adaptere og indekserende strekkoder.

Høysensitiv DNA-elektroforese med Bioanalyzer-systemet vil bli gjort for å forbedre kvalitetskontrollanalysen av NGS-biblioteket.

3- 16S rRNA genbibliotek forberedelse og MiSeq sekvensering. PCR-amplifisering av 16S rRNA, sekvensering og analyser vil bli utført av NGS Illumina rettet mot V1-V2 og V3-V4-regionen. 16S rRNA-genamplikonsekvensering (16S-analyse) vil bli brukt til å analysere mikrobiota med neste generasjons sekvenseringsteknologi. 16S analysedata fra standard V1-V2, V3-V4 primersett for å optimalisere blæremikrobiotaanalyseprotokollen.

4- Bioinformatikk og statistiske analyser. Det kommenterte genomet analyseres videre ved hjelp av bioinformatiske rørledninger for å få innsikt i patogenets biologi og potensiale for å forårsake sykdom.

Referanser

1. Bučević Popović V, Šitum M, Chow CT, Chan LS, Roje B, Terzić J. Urinmikrobiomet assosiert med blærekreft. Sci Rep. 2018 Aug 14;8(1):12157. doi: 10.1038/s41598-018-29054-w.
2. Wishahi, M., Otto, T. & Golka, K. Re: blærekarsinomer hos pasienter med nevrogen blære- og urinschistosomiasis - er de de samme svulstene?. World J Urol 40, 2139-2140 (2022). https://doi.org/10.1007/s00345-022-04076-2
3. Hanan R, Murata M, Ma N, Hammam O, Wishahi M, El Leithy T, Hiraku Y, Oikawa S, Kawanishi S (2012) Kjernefysisk lokalisering av COX-2 i forhold til uttrykk for stamnessmarkører i urinblærekreft. Mediat Inflamm 2012:165879 2012;2012:165879. doi: 10.1155/2012/165879.
4. Cancrini F, Michel F, Cussenot O, Alshehhi H, Comperat E, Phé V (2022) Blærekarsinomer hos pasienter med nevrogen blære og urinschistosomiasis: er de de samme svulstene? Verden J Urol. https://doi.org/10.1007/s00345-022-03941-4
5. Hammam O, Wishahi M, Khalil H, El Ganzouri H, Badawy M, Elkhquly A, Elesaily K (2014) Uttrykk av cytokeratin 7, 20, 14 i urotelialt karsinom og plateepitelkarsinom av egyptisk urinblærekreft. J Egypt Soc Parasitol 44(3):733-740
6. Zitvogel L, Daillère R, Roberti MP, Routy B, Kroemer G. Antikrefteffekter av mikrobiomet og dets produkter. Nat. Rev. Microbiol. 2017;15:109-128. doi: 10.1038/nrmicro.2017.44.
7. Whiteside SA, Razvi H, Dave S, Reid G, Burton JP. Mikrobiomet i urinveiene - en rolle utover infeksjon. Nat. Rev. Urol. 2015;12:81-90. doi: 10.1038/nrurol.2014.361.
8. Xu W, et al. Mini-gjennomgang: perspektiv av mikrobiomet i patogenesen av urotelialt karsinom. Er. J. Clin. Exp. Urol. 2014;2:57-61.
9. Brubaker, L., Gourdine, J.-P. F., Siddiqui, N. Y., Holland, A., Halverson, T., Limeria, R., et al. (2021a). Danner konsensus for å fremme urobiomforskning. mSystems 6, e0137120. doi: 10.1128/mSystems.01371-20
10. Brubaker, L., Putonti, C., Dong, Q., og Wolfe, A. J. (2021b). Det menneskelige urobiom. Mamma. Genome 32, 232-238. doi: 10.1007/s00335-021-09862-8
11. -Carrasco, V., Soriano-Lerma, A., Soriano, M., J. og Garcia-Salcedo, J.A. (2021). Urinmikrobiom: Yin og Yang i urinveiene. Front. Celle. Infisere. Microbiol. 11. doi: 10.3389/fcimb.2021.617002
12. 43. Wu N, et al. Dysbiose signatur av fekal mikrobiota hos kolorektal kreftpasienter. Microb. Ecol. 2013;66:462-470. doi: 10.1007/s00248-013-0245-9.