La microbiota en la orina y el urotelio pueden ser un factor de inducción del cáncer de vejiga urinaria. El estudio examinará los tejidos cancerosos de orina y vejiga de pacientes masculinos y la orina de controles utilizando técnicas de secuenciación genómica completa y ARNr 16S. El objetivo es dilucidar el papel de la microbiota en la vejiga (Cancer bladder)

-Racionalidad y objetivos:

A- Cáncer de vejiga:

Justificación Se estima que el cáncer de vejiga es la novena enfermedad maligna más frecuente, con 160.000 o más muertes por año en todo el mundo.

Cada vez hay más conciencia sobre el importante papel de los microbios que habitan en el tracto urinario y que desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la salud y el desarrollo de enfermedades y cáncer de vejiga [1].

Existe una correlación bien establecida entre el inicio del cáncer de vejiga y agentes microbianos específicos [2,3,4,5,].

El daño del ADN del huésped podría iniciarse directamente a través de genotoxinas producidas por cepas específicas de E. coli o mediante una ruta indirecta iniciando especies oxidativas. El microbioma y sus productos tienen un efecto anticancerígeno [6].

Tradicionalmente, la orina y el urotelio vesical se han considerado estériles en individuos sanos. Este concepto se basó en urocultivos microbiológicos estándar. Recientemente, se están acumulando pruebas y evidencias de que el tracto urinario también alberga distintos microorganismos comensales. El microbioma urinario se ha informado en individuos sanos [7].

El microbioma urinario en el cáncer de vejiga se ha investigado con poca frecuencia; se informó que Streptococcus sp estaba enriquecido en la vejiga de algunos pacientes con cáncer de vejiga [8].

Bučević Popović V et al [1] informaron que: "Las comunidades bacterianas presentes en muestras de orina de pacientes masculinos con cáncer de vejiga y de individuos sanos se analizaron mediante secuenciación 16S. Los resultados muestran que el filo más abundante en ambos grupos fue Firmicutes, seguido de Actinobacteria, Bacteroidetes y Proteobacteria. En el cáncer de vejiga se enriqueció significativamente el género Fusobacterium, que es un posible patógeno protumorigénico. En los tejidos cancerosos de vejiga, las secuencias de Fusobacterium nucleatum detectadas por PCR de los géneros Veillonella, Streptococcus y Corynebacterium fueron más abundantes en orinas sanas. Campylobacter hominis se enriqueció en muestras de orina de pacientes con cáncer de vejiga, las especies de Campylobacter son potencialmente patógenas ya que producen toxinas, invaden las células epiteliales y pueden evitar las respuestas inmunes del huésped".

La microbiota puede proporcionar efectos supresores de tumores al huésped humano [6]. Las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) han permitido perfilar comunidades microbianas en hábitats específicos. La secuenciación del gen del ARN ribosomal (ARNr) 16S se utiliza para elaborar perfiles de microbiota con tecnologías NGS. Elegir qué región hipervariable del ARNr 16S secuenciar es fundamental en los estudios de perfiles de microbiota. Las nueve regiones hipervariables de 16S rRNA son taxonómicamente informativas, pero debido a la variabilidad en el rendimiento de la elaboración de perfiles específicamente, la elección de la región hipervariable de 16S rRNA ideal dependerá de la composición bacteriana del hábitat bajo estudio. Las comunidades microbianas que colonizan el tracto urinario (el urobioma) se identifican en V4, V5. Estudios recientes han demostrado que la disbiosis del urobioma está relacionada con varias afecciones urológicas [9,10,11] y cáncer de vejiga [12].

Objetivos: Por tanto, es crucial caracterizar el urobioma en salud y el cáncer de vejiga, y puede conducir a nuevas estrategias de prevención, diagnóstico y tratamiento del cáncer de vejiga.

Objetivos El objetivo de este estudio de investigación es caracterizar la microbiota urinaria de pacientes varones adultos con cáncer de vejiga y correlacionarse con la microbiota en controles varones adultos sanos.

2-Metodología 2-1 Tipo de estudio: Estudio prospectivo de casos y controles 2-2 Criterios de inclusión, exclusión, proceso de reclutamiento. [A los pacientes incluidos en el estudio se les pedirá que ofrezcan un consentimiento informado, el Dr. Loay Mostafa y el Dr. Mohamed Sahab del Departamento de Urología - TBRI serán responsables de este elemento].

Criterios de inclusión:

• Hombres adultos mayores de 18 años,
• Diagnosticado de carcinoma de vejiga mediante ecografía y/o tomografía computarizada y citología de orina.
• Cáncer de vejiga confirmado ya sea durante cistoscopia diagnóstica, patología previa o examen patológico de las muestras de biopsia.

Criterio de exclusión:

• Radioterapia previa a la vejiga o al órgano adyacente.
• Inmunoterapia intravesical previa con bacilo de Calmette-Guérin (BCG), o instilación intravesical de quimioterapéuticos.
• Quimioterapia neoadyuvante previa. Proceso de reclutamiento Pacientes que cumplan los criterios de exclusión e inclusión. 2-3 Tamaño de la muestra Treinta y ocho hombres egipcios, de ≥ 18 años, serán reclutados en el Departamento de Urología, TBRI según el cálculo del tamaño de la muestra utilizando software en línea (Calculadora del tamaño de la muestra). Se recolectarán diez muestras de orina de individuos normales.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html El tamaño de la muestra será 16 para el cáncer de vejiga no músculo invasivo (NMIBC). Esto significa que se necesitan 16 o más mediciones/encuestas para tener un nivel de confianza del 95%. El tamaño de la muestra será 11 para el cáncer de vejiga con invasión muscular (MIBC). Esto significa que se necesitan 40 o más mediciones/encuestas para tener un nivel de confianza del 95%. El tamaño de la muestra será 11 para el grupo de control. Esto significa que se necesitan 10 o más mediciones/encuestas para tener un nivel de confianza del 95% A. Se reclutarán 38 hombres en el Departamento de Urología, TBRI. Según cálculo del tamaño de la muestra utilizando software en línea (Sample Size Calculator). Se recolectarán once muestras de orina de El tamaño de la muestra será 16 para el cáncer de vejiga no músculo invasivo (NMIBC). Esto significa que se necesitan 16 o más mediciones/encuestas para tener un nivel de confianza del 95% de que el valor real está dentro de ±17,53% del valor medido/encuestado.

El tamaño de la muestra será 11 para el cáncer de vejiga con invasión muscular (MIBC). Esto significa que se necesitan 11 o más mediciones/encuestas para tener un nivel de confianza del 95 % de que el valor real está dentro de ±30,36 % del valor medido/encuestado.

El tamaño de la muestra será 11 para el grupo de control. Esto significa que se necesitan 11 o más mediciones/encuestas para tener un nivel de confianza del 95 % de que el valor real está dentro de ±30,36 % del valor medido/encuestado.

individuos normales. Esta muestra representa la investigación sobre el microbioma en el cáncer de vejiga.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Recogida de muestras

Cáncer de vejiga:

El número total de muestras estudiadas: El estudio explorará la microbiota en orina y en muestras de tejido, por lo que cada paciente con cáncer de vejiga dará (2 muestras). El grupo de control dará una muestra de orina (una muestra). Investigaciones recientes demostraron que la microbiota se detecta en el urotelio de personas normales y de pacientes con cáncer de vejiga; esta microbiota diferiría de la microbiota de la orina (líquida).

Referencias:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Microbiota relacionada con el cáncer de vejiga: examen de diferencias en muestras de orina y tejido. Sci Rep. 6 de julio de 2020; 10 (1): 11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Perfilado de la microbiota vesical en pacientes con cáncer de vejiga. Microbiol frontal. 7 de febrero de 2022; 12: 718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   Grupo I: Cáncer de vejiga no músculo invasivo, 16 pacientes, 16 para tejido vesical y 16 para muestras de orina. Total de 32 muestras. (El estudio explorará la microbiota en orina y en muestras de tejido, por lo que cada paciente con cáncer de vejiga dará (2 muestras). El grupo de control dará una muestra de orina (una muestra). Investigaciones recientes demostraron que la microbiota se detecta en el urotelio de individuos normales y pacientes con cáncer de vejiga, esta microbiota diferiría de la microbiota de la orina (líquida). (Referencias:) Grupo II: Cáncer de vejiga con invasión muscular, 11 pacientes. 22 muestras 11 de tejido vesical y 11 de orina obtenidas de los mismos pacientes. Grupo III: 11 adultos normales: las muestras de orina sirven como grupo de control del estudio.

   El número total de participantes es 38 personas.

   Muestras para análisis de microbioma:

   Las muestras se recolectarán en recipientes limpios a prueba de fugas, sin residuos de desinfectante o detergente y con tapas herméticas a prueba de fugas y se conservarán en un refrigerador hasta su análisis en el laboratorio de microbiología de TBRI.

   Se recolectarán muestras de orina (50 ml) para el análisis del microbioma durante el examen de cistoscopia. Las muestras se almacenarán a -80 °C hasta su procesamiento.

   Muestras de tejido y orina de pacientes con cáncer de vejiga: según el procedimiento estándar de cistoscopia diagnóstica, se recolectará una muestra de orina en condiciones completamente asépticas, los pacientes con tumor de vejiga se someterán a una resección transuretral del tumor de vejiga y se investigará una muestra de tejido de 0,5x0,5 cm para el análisis del microbioma. Las muestras se almacenarán a -80 °C hasta su procesamiento. El diagnóstico histopatológico con tinción con hematoxilina y eosina lo realizará un patólogo experto para determinar el grado y estadio del tumor de acuerdo con las pautas de la OMS 22 y la EAU 2023. Este procedimiento se aplicará tanto para el carcinoma urotelial no músculo invasivo como para el músculo invasivo. Los pacientes que se someterán a una cistectomía radical por cáncer de vejiga se incluirán en el tamaño de la muestra.

   Muestras para estudios patológicos:

   Las muestras de tejido se fijarán con formalina y se examinarán con tinción de hematoxilina y eosina.

   Información clínica Los urólogos proporcionarán muestras de tejido adecuadas, que son una pequeña parte de todo el tumor resecado o una parte de las muestras de cistectomía. para la evaluación patológica que brinda información clínica útil al patólogo para decidir el mejor enfoque en el manejo y procesamiento de las muestras quirúrgicas y elaborar un informe patológico preciso.

   El urólogo especificará:

   • Datos demográficos e historia clínica del paciente, antecedentes de infección del tracto urinario y si fue recurrente o esporádica, citología de vejiga si está presente, si es la primera presentación del tumor y en caso contrario, detalles del manejo previo.
   • El aspecto cistoscópico de la mucosa de la vejiga indica el número, el tamaño, la ubicación del tumor o los tumores y las características morfológicas de la lesión: papilar, sólida o ulcerada.
   • El estado de la mucosa restante si se realizaran más biopsias.

   Esta información es necesaria para una correcta evaluación del urotelio y búsqueda en microbioma. Porque los tratamientos pueden tener un impacto en la morfología del tumor y en el urotelio de aspecto normal.

   Informes de muestras de cáncer de vejiga

   • Evaluación patológica El patólogo diagnosticará si hay cáncer de vejiga y el tipo de cáncer de vejiga, examinando las células de la biopsia del tejido de la vejiga. Se informarán diferentes tipos de tumores histológicos de cáncer de vejiga según la clasificación de tumores de vejiga urinaria de la OMS de 2016 (Mazzucchelli et al. 2021), modificada en 2022.
   • Evaluación microbiológica: métodos de identificación microbiana a partir de orina y tejidos.

   Condiciones de recolección y cultivo de muestras de aislados bacterianos clínicos:

   Detección de un número limitado de microorganismos, principalmente bacterias aeróbicas y de rápido crecimiento.

   Identificación de aislados bacterianos: Los aislados se identificarán mediante cultivo en sangre, agar MacConkey y agar sabaruds luego se identificarán mediante la realización de pruebas bioquímicas, prueba de oxidasa manitol, bilis esculina y prueba de catalasa. Todos los aislamientos se identificarán a nivel de especie mediante el sistema compacto Vitek 2.

   2-5 Evaluación de bioquímica y biología molecular: Análisis de secuenciación metagenómica 16S Se aplicará secuenciación genómica completa (WGS) a todos los casos, la metodología y el control de calidad son de acuerdo con el centro genómico y metagenómico del hospital oncológico infantil 57357 quienes van a realizar la Secuenciación WGS y 16S en muestras de orina y tejido.

1- Aislamiento de ADN de orina y tejido. Las muestras de orina (50 ml) se descongelarán y centrifugarán a 7500 g, 4 ° C durante 10 minutos. El sedimento se utilizará para la extracción de ADN utilizando el kit de purificación de ADN del microbioma Invitrogen™ PureLink™, realizado según el protocolo del fabricante. Para evitar la contaminación ambiental, todos los aislamientos de muestras de orina y del control de extracción solo con reactivo se realizarán dentro de una campana de PCR. Las muestras de ADN aisladas se colocarán a -20 °C hasta la amplificación por PCR. El ADN se cuantificará utilizando el kit de ensayo de alta sensibilidad DeNovix dsDNA (Illumina 2013).

2- Los kits de cuantificación de bibliotecas KABA KAPA basados ​​en PCR contienen todos los reactivos necesarios para la cuantificación precisa, confiable y reproducible basada en qPCR de bibliotecas de secuenciación de próxima generación (NGS) preparadas para la secuenciación en plataformas Illumina. Los kits incluyen KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (formulado con diferentes tintes de referencia pasivos para diferentes instrumentos qPCR), una premezcla de cebador de cuantificación de biblioteca específica de la plataforma y un conjunto de estándares de ADN prediluidos.

La región V3-V4 del gen 16S rRNA se amplificará con cebadores de fusión que incorporan adaptadores Illumina y códigos de barras de indexación. El paso de PCR agrega el índice 1 (i7) y el índice 2 (i5), secuenciación y adaptadores comunes (P5 y P7) necesarios para la generación y secuenciación de grupos. Se realizará electroforesis de ADN de alta sensibilidad con el sistema Bioanalyzer para mejorar el análisis de control de calidad de la biblioteca NGS. 3- Preparación de biblioteca de genes 16S rRNA y secuenciación MiSeq. La amplificación por PCR del ADNr 16S, la secuenciación y los análisis se realizarán mediante NGS Illumina MiSeq dirigido a la región V3V4 de la bacteria MiSeq Reagent Kit v3 (600 ciclos). La secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA (análisis 16S) se utiliza ampliamente para analizar la microbiota con tecnologías de secuenciación de próxima generación. Datos de análisis 16S de los conjuntos de cebadores estándar V3-V4 (V34) para optimizar el protocolo de análisis de microbiota de la vejiga. 4- Bioinformática y análisis estadísticos. El genoma anotado se analiza más a fondo mediante procesos bioinformáticos para obtener información sobre la biología del patógeno y su potencial para causar enfermedades. Incluye:

- Control de calidad y mejora del borrador del genoma eliminando errores y rellenando lagunas.

• Anotación del genoma final, incluida la identificación y descripción de las funciones de los genes y otras características.
• Genómica comparada, que implica comparar el genoma recién secuenciado con el de patógenos relacionados para identificar diferencias y similitudes.
• Análisis funcional: implica identificar las funciones de los genes anotados y comprender las vías y procesos en los que participan. Esto puede revelar factores clave de virulencia y ayudar a comprender el mecanismo de patogénesis del patógeno.
• Análisis filogenético: consiste en comparar el genoma recién secuenciado con el de
• patógenos relacionados para determinar las relaciones evolutivas y rastrear la propagación de patógenos en diferentes poblaciones.
• Diferencias en la composición microbiana general entre el cáncer de vejiga y el sano.

• Se evaluarán las muestras. NGS no está disponible en TBRI, la secuenciación 16S y la bioinformática se realizarán de forma paga en Children Hospital 57357 (pueden realizar la secuenciación según un principio de "pago").

  Análisis de secuenciación del ARN ribosómico (ARNr) 16S

  1. Aislamiento de ADN de orina y tejido. Las muestras de orina (50 ml) se descongelarán y centrifugarán a 7500 g, 4 ° C durante 10 minutos. El sedimento se utilizará para la extracción de ADN utilizando el kit de purificación de ADN del microbioma. Para evitar la contaminación ambiental, todos los aislamientos de muestras de orina y del control de extracción solo con reactivo se realizarán dentro de una campana de PCR. Las muestras de ADN aisladas se colocarán a -20 °C hasta la amplificación por PCR. El ADN se cuantificará mediante un kit de ensayo (Illumina 2013).
  2. Los kits de cuantificación de bibliotecas KABA KAPA basados ​​en PCR contienen todos los reactivos necesarios para la cuantificación precisa, confiable y reproducible basada en qPCR de bibliotecas de secuenciación de próxima generación (NGS) preparadas para la secuenciación en plataformas Illumina. Una premezcla de cebador de cuantificación de biblioteca específica de la plataforma y un conjunto de estándares de ADN prediluidos.

  Las regiones hipervariables del ARNr 16S, la región V1V2 y V3-V4, se amplificarán con cebadores de fusión que incorporan adaptadores Illumina y códigos de barras de indexación.

Se realizará electroforesis de ADN de alta sensibilidad con el sistema Bioanalyzer para mejorar el análisis de control de calidad de la biblioteca NGS.

3- Preparación de biblioteca de genes 16S rRNA y secuenciación MiSeq. NGS Illumina realizará la amplificación por PCR del ARNr 16S, la secuenciación y los análisis dirigidos a las regiones V1-V2 y V3-V4. La secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA (análisis 16S) se utilizará para analizar la microbiota con tecnologías de secuenciación de próxima generación. Datos de análisis 16S de los conjuntos de cebadores estándar V1-V2, V3-V4 para optimizar el protocolo de análisis de microbiota de la vejiga.

4- Bioinformática y análisis estadísticos. El genoma anotado se analiza más a fondo mediante procesos bioinformáticos para obtener información sobre la biología del patógeno y su potencial para causar enfermedades.

Referencias

1. Bučević Popović V, Šitum M, Chow CT, Chan LS, Roje B, Terzić J. El microbioma urinario asociado con el cáncer de vejiga. Sci Rep. 14 de agosto de 2018;8(1):12157. doi: 10.1038/s41598-018-29054-w.
2. Wishahi, M., Otto, T. & Golka, K. Re: carcinomas de vejiga en pacientes con vejiga neurogénica y esquistosomiasis urinaria: ¿son los mismos tumores? Mundo J Urol 40, 2139-2140 (2022). https://doi.org/10.1007/s00345-022-04076-2
3. Hanan R, Murata M, Ma N, Hammam O, Wishahi M, El Leithy T, Hiraku Y, Oikawa S, Kawanishi S (2012) Localización nuclear de COX-2 en relación con la expresión de marcadores de tallo en el cáncer de vejiga urinaria. Mediat Inflamm 2012:165879 2012;2012:165879. doi: 10.1155/2012/165879.
4. Cancrini F, Michel F, Cussenot O, Alshehhi H, Comperat E, Phé V (2022) Carcinomas de vejiga en pacientes con vejiga neurogénica y esquistosomiasis urinaria: ¿son los mismos tumores? Mundo J Urol. https://doi.org/10.1007/s00345-022-03941-4
5. Hammam O, Wishahi M, Khalil H, El Ganzouri H, Badawy M, Elkhquly A, Elesaily K (2014) Expresión de citoqueratina 7, 20, 14 en el carcinoma urotelial y el carcinoma de células escamosas del cáncer de vejiga urinaria egipcio. J Egipto Soc Parasitol 44(3):733-740
6. Zitvogel L, Daillère R, Roberti MP, Routy B, Kroemer G. Efectos anticancerígenos del microbioma y sus productos. Nat. Rev. Microbiol. 2017;15:109-128. doi: 10.1038/nrmicro.2017.44.
7. Whiteside SA, Razvi H, Dave S, Reid G, Burton JP. El microbioma del tracto urinario: una función más allá de la infección. Nat. Rev. Urol. 2015;12:81-90. doi: 10.1038/nrurol.2014.361.
8. Xu W, et al. Minirevisión: perspectiva del microbioma en la patogénesis del carcinoma urotelial. Soy. J.Clin. Exp. Urol. 2014;2:57-61.
9. Brubaker, L., Gourdine, J.-P. F., Siddiqui, N. Y., Holland, A., Halverson, T., Limeria, R., et al. (2021a). Formar consenso para avanzar en la investigación del urobioma. mSystems 6, e0137120. doi: 10.1128/mSystems.01371-20
10. Brubaker, L., Putonti, C., Dong, Q. y Wolfe, AJ (2021b). El urobioma humano. Mamá. Genoma 32, 232-238. doi: 10.1007/s00335-021-09862-8
11. -Carrasco, V., Soriano-Lerma, A., Soriano, M., J. y García-Salcedo, J. A. (2021). Microbioma urinario: Yin y Yang del tracto urinario. Frente. Celúla. Infectar. Microbiol. 11.doi: 10.3389/fcimb.2021.617002
12. 43. Wu N, et al. Firma de disbiosis de la microbiota fecal en pacientes con cáncer colorrectal. Microbio. Ecológico. 2013;66:462-470. doi: 10.1007/s00248-013-0245-9.