Il microbiota nelle urine e nell’urotelio può essere un fattore di induzione del cancro della vescica urinaria. Lo studio esaminerà l'urina e i tessuti tumorali della vescica di pazienti di sesso maschile e l'urina di controlli utilizzando tecniche di sequenziamento genomico intero e rRNA 16S. L'obiettivo è chiarire il ruolo del microbiota nella vescica (Cancer bladder)

-Razionalità e obiettivi:

A- Cancro alla vescica:

Motivazione Si stima che il cancro della vescica sia la nona malattia maligna più frequente, con 160.000 o più decessi all'anno stimati a livello globale.

Vi è una crescente consapevolezza dell’importante ruolo dei microbi che popolano le vie urinarie, i quali svolgono un ruolo importante nel mantenimento della salute e nello sviluppo di malattie e cancro della vescica [1].

Esiste una correlazione ben consolidata tra l’insorgenza del cancro della vescica e specifici agenti microbici [2,3,4,5,].

Il danno al DNA ospite potrebbe essere avviato direttamente tramite genotossine prodotte da specifici ceppi di E. coli o tramite una via indiretta avviando specie ossidative. Il microbioma e i suoi prodotti hanno un effetto antitumorale [6].

Tradizionalmente, l'urina e l'urotelio della vescica sono stati considerati sterili negli individui sani. Questo concetto era basato su colture di urina microbiologiche standard. Recentemente si stanno accumulando prove ed evidenze che il tratto urinario ospita anche distinti microrganismi commensali. Il microbioma urinario è stato segnalato in individui sani [7].

Il microbioma urinario nel cancro della vescica è stato studiato raramente, è stato riportato che Streptococcus sp era arricchito nella vescica di alcuni pazienti con cancro della vescica [8].

Bučević Popović V et al [1] hanno riferito che: "Le comunità batteriche presenti nei campioni di urina di pazienti maschi con cancro alla vescica e di individui sani sono state analizzate utilizzando il sequenziamento 16S. I risultati mostrano che il phylum più abbondante in entrambi i gruppi era Firmicutes, seguito da Actinobacteria, Bacteroidetes e Proteobacteria. Significativamente arricchito nel cancro della vescica era il genere Fusobacterium, che è un possibile agente patogeno protumorigenico. Nei tessuti tumorali della vescica, le sequenze di Fusobacterium nucleatum rilevate mediante PCR dei generi Veillonella, Streptococcus e Corynebacterium erano più abbondanti nelle urine sane. Campylobacter hominis è stato arricchito in campioni di urina di pazienti con cancro alla vescica, le specie Campylobacter sono potenzialmente patogene poiché producono tossine, invadono le cellule epiteliali e possono evitare le risposte immunitarie dell'ospite".

Il microbiota può fornire effetti di soppressione del tumore all’ospite umano [6]. Le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) hanno consentito la profilazione delle comunità microbiche in habitat specifici. Il sequenziamento del gene dell’RNA ribosomiale 16S (rRNA) viene utilizzato per la profilazione del microbiota con tecnologie NGS. È importante scegliere quale regione ipervariabile dell'rRNA 16S sequenziare sia fondamentale negli studi di profilazione del microbiota. Tutte e nove le regioni ipervariabili dell'rRNA 16S sono tassonomicamente informative, ma a causa della variabilità nelle prestazioni di profilazione specificatamente, la scelta della regione ipervariabile dell'rRNA 16S ideale dipenderà dalla composizione batterica dell'habitat in esame. Le comunità microbiche che colonizzano il tratto urinario (l'urobioma) sono identificate in V4,V5. Studi recenti hanno dimostrato che la disbiosi dell’urobioma è collegata a diverse condizioni urologiche [9,10,11] e al cancro della vescica [12].

Obiettivi: Pertanto, è fondamentale caratterizzare l’urobioma per la salute e il cancro della vescica e potrebbe portare a nuove strategie di prevenzione, diagnosi e trattamento per il cancro della vescica.

Obiettivi Lo scopo di questo studio di ricerca è caratterizzare il microbiota urinario di pazienti maschi adulti con cancro della vescica e correlarlo con il microbiota nei controlli maschi adulti sani.

2-Metodologia 2-1 Tipo di studio: studio prospettico caso-controllo 2-2 Inclusione, criteri di esclusione, processo di reclutamento. [ai pazienti inclusi nello studio verrà chiesto di offrire un consenso informato, il dottor Loay Mostafa e il dottor Mohamed Sahab del Dipartimento di Urologia - TBRI saranno responsabili di questo articolo].

Criterio di inclusione:

• Uomini adulti sopra i 18 anni,
• Diagnosi di carcinoma della vescica con ecografia per immagini e/o tomografia computerizzata e citologia delle urine.
• Cancro della vescica confermato durante cistoscopia diagnostica, patologia precedente o esame patologico dei campioni bioptici.

Criteri di esclusione:

• Precedente radioterapia alla vescica o ad organo adiacente.
• Precedente immunoterapia con instillazione intravescicale con bacillo Calmette-Guérin (BCG) o instillazione intravescicale di chemioterapici.
• Precedente chemioterapia neoadiuvante. Processo di reclutamento Pazienti che soddisfano i criteri di esclusione e inclusione. 2-3 Dimensione del campione Trentotto uomini egiziani, di età ≥ 18 anni, saranno reclutati presso il Dipartimento di Urologia, TBRI in base al calcolo della dimensione del campione utilizzando il software online (Sample Size Calculator). Verranno raccolti dieci campioni di urina da individui normali.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html La dimensione del campione sarà 16 per il cancro della vescica non muscolo-invasivo (NMIBC). Ciò significa che sono necessarie 16 o più misurazioni/rilievi per avere un livello di confidenza del 95%. La dimensione del campione sarà 11 per il cancro della vescica muscolo invasivo (MIBC). Ciò significa che sono necessarie 40 o più misurazioni/rilievi per avere un livello di confidenza del 95%. La dimensione del campione sarà 11 per il gruppo di controllo. Ciò significa che sono necessarie 10 o più misurazioni/esami per avere un livello di confidenza del 95% A. 38 uomini saranno reclutati presso il Dipartimento di Urologia, TBRI. In base al calcolo della dimensione del campione utilizzando il software online (Sample Size Calculator). Verranno raccolti undici campioni di urina dalla dimensione del campione sarà 16 per il cancro della vescica non muscolo-invasivo (NMIBC). Ciò significa che sono necessarie 16 o più misurazioni/rilievi per avere un livello di confidenza del 95% che il valore reale sia entro ±17,53% del valore misurato/rilevato.

La dimensione del campione sarà 11 per il cancro della vescica muscolo invasivo (MIBC). Ciò significa che sono necessarie 11 o più misurazioni/rilievi per avere un livello di confidenza del 95% che il valore reale sia entro ±30,36% del valore misurato/rilevato.

La dimensione del campione sarà 11 per il gruppo di controllo. Ciò significa che sono necessarie 11 o più misurazioni/rilievi per avere un livello di confidenza del 95% che il valore reale sia entro ±30,36% del valore misurato/rilevato.

individui normali. Questo campione rappresenta la ricerca sul microbioma nel cancro della vescica.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Raccolta dei campioni

Cancro alla vescica:

Il numero totale di campioni studiati: lo studio esplorerà il microbiota nelle urine e nei campioni di tessuto, quindi ogni paziente con cancro alla vescica fornirà (2 campioni). Il gruppo di controllo fornirà un campione di urina (un campione). Ricerche recenti hanno dimostrato che il microbiota viene rilevato nell’urotelio di individui normali e di pazienti con cancro alla vescica; questo microbiota differirebbe dal microbiota delle urine (liquido).

Riferimenti:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Microbiota correlato al cancro della vescica: esame delle differenze nei campioni di urina e di tessuto. Rappresentante Sci. 2020 lug 6;10(1):11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Profilazione del microbiota della vescica in pazienti con cancro alla vescica. Microbiolo anteriore. 2022 febbraio 7;12:718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   Gruppo I: cancro della vescica non muscolo-invasivo, 16 pazienti, 16 per tessuto vescicale e 16 per campioni di urina. Totale 32 campioni. (Lo studio esplorerà il microbiota nelle urine e nei campioni di tessuto, quindi ogni paziente con cancro alla vescica fornirà (2 campioni). Il gruppo di controllo fornirà un campione di urina (un campione). Ricerche recenti hanno dimostrato che il microbiota viene rilevato nell'urotelio di individui normali e di pazienti con cancro della vescica; questo microbiota differirebbe dal microbiota dell'urina (liquido). (Riferimenti:) Gruppo II: cancro della vescica muscolo-invasivo, 11 pazienti. 22 campioni 11 di tessuto vescicale e 11 di campioni di urina ottenuti dagli stessi pazienti. Gruppo III: 11 adulti normali: i campioni di urina fungono da gruppo di controllo dello studio.

   Il numero totale dei partecipanti è di 38 individui.

   Campioni per l'analisi del microbioma:

   I campioni verranno raccolti in contenitori puliti a tenuta stagna senza residui di disinfettante o detergente e con coperchi a tenuta stagna e conservati in frigorifero fino all'analisi presso il laboratorio di microbiologia del TBRI.

   Durante l'esame cistoscopico verranno raccolti campioni di urina (50 ml) per l'analisi del microbioma. I campioni verranno conservati a -80 °C fino al trattamento.

   Campioni di tessuto e urina da pazienti con cancro della vescica: secondo la procedura standard della cistoscopia diagnostica, il campione di urina verrà raccolto in condizioni completamente asettiche, i pazienti che hanno un tumore alla vescica verranno sottoposti a resezione transuretrale del tumore della vescica, verrà studiato un campione di tessuto di 0,5x0,5 cm per l’analisi del microbioma. I campioni verranno conservati a -80 °C fino al trattamento. La diagnosi istopatologica con colorazione con ematossilina ed eosina verrà effettuata da un patologo esperto per grado e stadio del tumore secondo le linee guida WHO 22 e EAU 2023. Questa procedura verrà applicata sia per il carcinoma uroteliale non muscolo-invasivo che per quello muscolo-invasivo. I pazienti che verranno sottoposti a cistectomia radicale per cancro alla vescica saranno inclusi nella dimensione del campione.

   Campioni per studi patologici:

   I campioni di tessuto verranno fissati con formalina ed esaminati con colorazione con ematossilina ed eosina.

   Informazioni cliniche Gli urologi forniranno campioni di tessuto adeguati che rappresentano una piccola parte dell'intero tumore asportato o una parte dei campioni di cistectomia. per la valutazione patologica fornendo informazioni cliniche utili al patologo per decidere l'approccio migliore nella manipolazione e processazione dei campioni chirurgici e redigere un accurato referto patologico.

   L'urologo specificherà:

   • Dati demografici e storia clinica del paziente, storia di infezione del tratto urinario e se fosse ricorrente o sporadica, citologia vescicale se presente, se si tratta della prima presentazione del tumore e in caso contrario, dettagli della precedente gestione.
   • L'aspetto cistoscopico della mucosa vescicale indica il numero, le dimensioni, la localizzazione del/i tumore/i, le caratteristiche morfologiche della lesione: papillare, solida o ulcerata.
   • Lo stato della mucosa rimanente se sono state eseguite ulteriori biopsie.

   Queste informazioni sono necessarie per una corretta valutazione dell'urotelio e per la ricerca nel microbioma. Perché i trattamenti possono avere un impatto sulla morfologia del tumore e sull’urotelio dall’aspetto normale.

   Refertazione dei campioni di cancro alla vescica

   • Valutazione patologica Il patologo diagnosticherà se è presente un cancro alla vescica e il tipo di cancro alla vescica, esaminando le cellule della biopsia del tessuto vescicale. Verranno riportati diversi tipi istologici di tumore della vescica secondo la classificazione OMS 2016 dei tumori della vescica urinaria (Mazzucchelli et al. 2021), modificata nel 2022.
   • Valutazione microbiologica: Metodi di identificazione microbica da urine e tessuti

   Raccolta dei campioni e condizioni di coltura degli isolati batterici clinici:

   Rilevamento di un numero limitato di microrganismi, principalmente batteri aerobici e a crescita rapida.

   Identificazione degli isolati batterici: Gli isolati verranno identificati mediante coltura su sangue, agar MacConkey e agar Sabaruds, quindi verranno identificati eseguendo test biochimici, test dell'ossidasi mannitolo, bile esculina e test della catalasi. Tutti gli isolati saranno identificati a livello di specie utilizzando il sistema compatto Vitek 2.

   2-5 Valutazione di biochimica e biologia molecolare: analisi di sequenziamento metagenomico 16S Il sequenziamento genomico completo (WGS) sarà applicato a tutti i casi, la metodologia e il controllo di qualità sono conformi al centro genomico e metagenomico dell'ospedale oncologico pediatrico 57357 che eseguirà il Sequenziamento WGS e 16S su campioni di urina e tessuti.

1- Isolamento del DNA da urina e tessuti. I campioni di urina (50 ml) verranno scongelati e centrifugati a 7500 g, 4°C per 10 minuti. Il pellet verrà utilizzato per l'estrazione del DNA utilizzando il kit di purificazione del DNA del microbioma Invitrogen™ PureLink™, eseguito secondo il protocollo del produttore. Per evitare la contaminazione ambientale, tutti gli isolamenti dai campioni di urina e dal controllo di estrazione con solo reagente verranno eseguiti all'interno di una cappa per PCR. I campioni di DNA isolati verranno posti a -20°C fino all'amplificazione tramite PCR. Il DNA verrà quantificato utilizzando il kit DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay (Illumina 2013).

2- I kit di quantificazione delle librerie KABA KAPA basati su PCR contengono tutti i reagenti necessari per la quantificazione accurata, affidabile e riproducibile basata su qPCR delle librerie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) preparate per il sequenziamento su piattaforme Illumina. I kit includono KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (formulato con diversi coloranti di riferimento passivi per diversi strumenti qPCR), una premiscela di primer di quantificazione della libreria specifica per piattaforma e un set prediluito di standard di DNA.

La regione V3-V4 del gene 16S rRNA sarà amplificata con primer di fusione che incorporano adattatori Illumina e codici a barre di indicizzazione. La fase PCR aggiunge l'indice 1 (i7) e l'indice 2 (i5), il sequenziamento e gli adattatori comuni (P5 e P7) necessari per la generazione e il sequenziamento dei cluster. Verrà eseguita l'elettroforesi del DNA ad alta sensibilità con il sistema Bioanalyzer per migliorare l'analisi del controllo di qualità della libreria NGS. Preparazione della libreria genetica 3- 16S rRNA e sequenziamento MiSeq. L'amplificazione PCR dell'rDNA 16S, il sequenziamento e le analisi saranno eseguiti da NGS Illumina MiSeq mirando alla regione V3V4 dei batteri MiSeq Reagent Kit v3 (600 cicli). Il sequenziamento dell’amplicone del gene rRNA 16S (analisi 16S) è ampiamente utilizzato per analizzare il microbiota con tecnologie di sequenziamento di prossima generazione. I dati di analisi 16S provenienti dai set di primer V3-V4 standard (V34) consentono di ottimizzare il protocollo di analisi del microbiota vescicale. 4- Bioinformatica e analisi statistiche. Il genoma annotato viene ulteriormente analizzato utilizzando canali bioinformatici per ottenere informazioni sulla biologia dell'agente patogeno e sul potenziale di causare malattie. Include:

- Controllo di qualità e miglioramento del progetto di genoma eliminando gli errori e colmando le lacune.

• Annotazione del genoma finale, inclusa l'identificazione e la descrizione delle funzioni dei geni e di altre caratteristiche.
• Genomica comparativa, che prevede il confronto del genoma appena sequenziato con quello di agenti patogeni correlati per identificare differenze e somiglianze.
• Analisi funzionale: comporta l'identificazione delle funzioni dei geni annotati e la comprensione dei percorsi e dei processi a cui partecipano. Ciò può rivelare fattori chiave di virulenza e aiutare a comprendere il meccanismo di patogenesi dell'agente patogeno.
• Analisi filogenetica: comporta il confronto del genoma appena sequenziato con quello di
• agenti patogeni correlati per determinare le relazioni evolutive e monitorare la diffusione degli agenti patogeni in diverse popolazioni.
• Differenze nella composizione microbica complessiva tra cancro alla vescica e soggetti sani

• verranno valutati i campioni NGS non è disponibile in TBRI, il sequenziamento 16S e la bioinformatica verranno eseguiti a pagamento presso l'ospedale pediatrico 57357 (sono benvenuti a eseguire il sequenziamento in base al principio "a pagamento").

  Analisi di sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S (rRNA).

  1. Isolamento del DNA da urina e tessuti. I campioni di urina (50 ml) verranno scongelati e centrifugati a 7500 g, 4°C per 10 minuti. Il pellet verrà utilizzato per l'estrazione del DNA utilizzando il kit di purificazione del DNA del microbioma. Per evitare la contaminazione ambientale, tutti gli isolamenti dai campioni di urina e dal controllo di estrazione con solo reagente verranno eseguiti all'interno di una cappa per PCR. I campioni di DNA isolati verranno posti a -20°C fino all'amplificazione mediante PCR. Il DNA sarà quantificato utilizzando un kit di analisi (Illumina 2013).
  2. I kit di quantificazione delle librerie KABA KAPA basati su PCR contengono tutti i reagenti necessari per la quantificazione accurata, affidabile e riproducibile basata su qPCR delle librerie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) preparate per il sequenziamento su piattaforme Illumina. Una premiscela di primer di quantificazione della libreria specifica per piattaforma e un set prediluito di standard di DNA.

  Le regioni ipervariabili dell'rRNA 16S Le regioni V1V2 e V3-V4 saranno amplificate con primer di fusione che incorporano adattatori Illumina e codici a barre di indicizzazione.

Verrà eseguita l'elettroforesi del DNA ad alta sensibilità con il sistema Bioanalyzer per migliorare l'analisi del controllo di qualità della libreria NGS.

Preparazione della libreria genetica 3- 16S rRNA e sequenziamento MiSeq. L'amplificazione PCR dell'rRNA 16S, il sequenziamento e le analisi saranno eseguiti mediante NGS Illumina mirando alla regione V1-V2 e V3-V4. Il sequenziamento dell'amplicone del gene rRNA 16S (analisi 16S) verrà utilizzato per analizzare il microbiota con tecnologie di sequenziamento di prossima generazione. Dati di analisi 16S dai set di primer standard V1-V2, V3-V4 per ottimizzare il protocollo di analisi del microbiota vescicale.

4- Bioinformatica e analisi statistiche. Il genoma annotato viene ulteriormente analizzato utilizzando canali bioinformatici per ottenere informazioni sulla biologia dell'agente patogeno e sul potenziale di causare malattie.

Riferimenti

1. Bučević Popović V, Šitum M, Chow CT, Chan LS, Roje B, Terzić J. Il microbioma urinario associato al cancro della vescica. Rappresentante Sci. 2018 14 agosto;8(1):12157. doi: 10.1038/s41598-018-29054-w.
2. Wishahi, M., Otto, T. & Golka, K. Re: carcinomi della vescica in pazienti con vescica neurogena e schistosomiasi urinaria: sono gli stessi tumori?. Mondo J Urol 40, 2139-2140 (2022). https://doi.org/10.1007/s00345-022-04076-2
3. Hanan R, Murata M, Ma N, Hammam O, Wishahi M, El Leithy T, Hiraku Y, Oikawa S, Kawanishi S (2012) Localizzazione nucleare di COX-2 in relazione all'espressione dei marcatori di staminalità nel cancro della vescica urinaria. Mediat Inflamm 2012:165879 2012;2012:165879. doi: 10.1155/2012/165879.
4. Cancrini F, Michel F, Cussenot O, Alshehhi H, Comperat E, Phé V (2022) Carcinomi della vescica in pazienti con vescica neurogena e schistosomiasi urinaria: sono gli stessi tumori? Mondo J Urol. https://doi.org/10.1007/s00345-022-03941-4
5. Hammam O, Wishahi M, Khalil H, El Ganzouri H, Badawy M, Elkhquly A, Elesaily K (2014) Espressione della citocheratina 7, 20, 14 nel carcinoma uroteliale e nel carcinoma a cellule squamose del cancro della vescica urinaria egiziana. J Egypt Soc Parasitol 44(3):733-740
6. Zitvogel L, Daillère R, Roberti MP, Routy B, Kroemer G. Effetti antitumorali del microbioma e dei suoi prodotti. Naz. Rev. Microbiol. 2017;15:109-128. doi: 10.1038/nrmicro.2017.44.
7. Whiteside SA, Razvi H, Dave S, Reid G, Burton JP. Il microbioma delle vie urinarie: un ruolo oltre l’infezione. Naz. Rev. Urol. 2015;12:81-90. doi: 10.1038/nrurol.2014.361.
8. Xu W, et al. Mini-recensione: prospettiva del microbioma nella patogenesi del carcinoma uroteliale. Sono. J. Clin. Esp. Urol. 2014;2:57-61.
9. Brubaker, L., Gourdine, J.-P. F., Siddiqui, N. Y., Holland, A., Halverson, T., Limeria, R., et al. (2021a). Formare il consenso per far avanzare la ricerca sull'urobioma. mSystems 6, e0137120. doi: 10.1128/mSystems.01371-20
10. Brubaker, L., Putonti, C., Dong, Q. e Wolfe, A. J. (2021b). L'urobioma umano. Mammà. Genoma 32, 232-238. doi: 10.1007/s00335-021-09862-8
11. -Carrasco, V., Soriano-Lerma, A., Soriano, M., J. e Garcia-Salcedo, J. A. (2021). Microbioma urinario: Yin e Yang delle vie urinarie. Davanti. Cellula. Infettare. Microbiolo. 11.doi: 10.3389/fcimb.2021.617002
12. 43.Wu N, et al. Firma della disbiosi del microbiota fecale nei pazienti con cancro del colon-retto. Microbo. Eco. 2013;66:462-470. doi: 10.1007/s00248-013-0245-9.