Mikrobiota v moči a urotelu může být faktorem pro indukci rakoviny močového měchýře. Studie bude zkoumat tkáně rakoviny moči a močového měchýře od mužských pacientů a moč kontrolních skupin pomocí technik sekvenování celého genomu a 16S rRNA. Cílem je objasnit roli mikrobioty v močovém měchýři (Cancer bladder)

- Racionalita a cíle:

A- Rakovina močového měchýře:

Odůvodnění Odhaduje se, že rakovina močového měchýře je devátým nejčastějším maligním onemocněním, s celosvětovým odhadem 160 000 nebo více úmrtí ročně.

Stále více si uvědomujeme důležitou roli mikrobů obývajících močové cesty, které hrají důležitou roli při udržování zdraví a rozvoji onemocnění a rakoviny močového měchýře [1].

Existuje dobře prokázaná korelace mezi iniciací karcinomu močového měchýře a specifickými mikrobiálními agens [2,3,4,5,].

Poškození hostitelské DNA může být přímo iniciováno prostřednictvím genotoxinů produkovaných specifickými kmeny E. coli nebo nepřímou cestou iniciací oxidačních druhů. Mikrobiom a jeho produkty působí protirakovinně [6].

Tradičně byly moč a urotel močového měchýře u zdravých jedinců považovány za sterilní. Tento koncept byl založen na standardních mikrobiologických kulturách moči. V poslední době se hromadí důkazy a důkazy o tom, že močové cesty také obsahují odlišné komenzální mikroorganismy. Močový mikrobiom byl popsán u zdravých jedinců [7].

Močový mikrobiom u karcinomu močového měchýře nebyl zkoumán často, bylo hlášeno, že Streptococcus sp byl obohacen v močovém měchýři některých pacientů s karcinomem močového měchýře [8].

Bučević Popović V et al [1] uvedli, že:" Bakteriální komunity přítomné ve vzorcích moči od mužských pacientů s rakovinou močového měchýře a od zdravých jedinců byly analyzovány pomocí sekvenování 16S. Výsledky ukazují, že nejhojnějším kmenem v obou skupinách byly Firmicutes, následované Actinobacteria, Bacteroidetes a Proteobacteria. Významně obohacený v rakovině močového měchýře byl rod Fusobacterium, který je možným protumorigenním patogenem. Ve tkáních rakoviny močového měchýře byly sekvence Fusobacterium nucleatum detekované pomocí PCR, rody Veillonella, Streptococcus a Corynebacterium hojnější ve zdravé moči. Campylobacter hominis byl obohacen ve vzorcích moči pacientů s rakovinou močového měchýře, druhy Campylobacter jsou potenciálně patogenní, protože produkují toxiny, napadají epiteliální buňky a mohou se vyhnout imunitním reakcím hostitele.

Mikrobiota může lidskému hostiteli poskytovat tumor-supresivní účinky [6]. Technologie sekvenování nové generace (NGS) umožnily profilování mikrobiálních společenstev ve specifických biotopech. Sekvenování genu 16S ribozomální RNA (rRNA) se používá pro profilování mikroflóry pomocí technologií NGS. Výběr, který 16S rRNA hypervariabilní region k sekvenování je kritický ve studiích profilování mikrobioty, je důležitý. Všech devět hypervariabilních oblastí 16S rRNA je taxonomicky informativních, ale vzhledem k variabilitě výkonu profilování bude výběr ideální hypervariabilní oblasti 16S rRNA záviset na bakteriálním složení studovaného stanoviště. Mikrobiální komunity kolonizující močové cesty (urobiom) jsou identifikovány ve V4, V5. Nedávné studie ukázaly, že dysbióza urobiomu je spojena s několika urologickými stavy [9,10,11] a rakovinou močového měchýře [12].

Cíle: Proto je zásadní charakterizovat urobiom u zdraví a rakoviny močového měchýře a může vést k novým strategiím prevence, diagnózy a léčby rakoviny močového měchýře.

Cíle Cílem této výzkumné studie je charakterizovat urinární mikroflóru dospělých pacientů mužského pohlaví s rakovinou močového měchýře a korelovat s mikroflórou u zdravých dospělých mužů.

2-Metodika 2-1 Typ studie: Prospektivní případová kontrolní studie 2-2 Inkluze, kritéria vyloučení, proces náboru. [zařazení pacienti do studie budou požádáni, aby nabídli informovaný souhlas, Dr. Loay Mostafa a Dr. Mohamed Sahab z Urologického oddělení – TBRI budou zodpovědní za tuto položku].

Kritéria pro zařazení:

• Dospělí muži nad 18 let,
• Diagnostikován karcinom močového měchýře pomocí zobrazovací ultrasonografie a/nebo počítačové tomografie a cytologie moči.
• Potvrzený karcinom močového měchýře buď během diagnostické cystoskopie, předchozí patologie nebo patologického vyšetření bioptických vzorků.

Kritéria vyloučení:

• Předchozí radioterapie močového měchýře nebo sousedního orgánu.
• Předchozí intravezikální instilační imunoterapie bacilem Calmette-Guérin (BCG), případně intravezikální instilace chemoterapeutik.
• Předchozí neoadjuvantní chemoterapie. Proces náboru Pacienti splňující kritéria vyloučení a zařazení. 2-3 Velikost vzorku Třicet osm egyptských mužů ve věku ≥ 18 bude přijato na Urologické oddělení, TBRI podle výpočtu velikosti vzorku pomocí online softwaru (Sample Size Calculator). Od normálních jedinců bude odebráno deset vzorků moči.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html Velikost vzorku bude 16 pro nesvalovou invazivní rakovinu močového měchýře (NMIBC). To znamená, že je potřeba 16 nebo více měření/průzkumů k dosažení úrovně spolehlivosti 95 %. Velikost vzorku bude 11 pro svalovou invazivní rakovinu močového měchýře (MIBC). To znamená, že je potřeba 40 nebo více měření/průzkumů k dosažení úrovně spolehlivosti 95 %. Velikost vzorku bude 11 pro kontrolní skupinu. To znamená, že je potřeba 10 nebo více měření/průzkumů, aby byla hladina spolehlivosti 95 % A. Na Urologickém oddělení TBRI bude přijato 38 mužů. Podle výpočtu velikosti vzorku pomocí online softwaru (Sample Size Calculator). Bude odebráno 11 vzorků moči. Velikost vzorku bude 16 pro nesvalovou invazivní rakovinu močového měchýře (NMIBC). To znamená, že je potřeba 16 nebo více měření/průzkumů, aby byla hladina spolehlivosti 95%, že skutečná hodnota je v rozmezí ±17,53% naměřené/zjišťované hodnoty.

Velikost vzorku bude 11 pro svalovou invazivní rakovinu močového měchýře (MIBC). To znamená, že je potřeba 11 nebo více měření/průzkumů, aby byla hladina spolehlivosti 95 %, že skutečná hodnota je v rozmezí ±30,36 % naměřené/zjišťované hodnoty.

Velikost vzorku bude 11 pro kontrolní skupinu. To znamená, že je potřeba 11 nebo více měření/průzkumů, aby byla hladina spolehlivosti 95 %, že skutečná hodnota je v rozmezí ±30,36 % naměřené/zjišťované hodnoty.

normální jedinci. Tento vzorek představuje výzkum mikrobiomu u rakoviny močového měchýře.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Sběr vzorků

Rakovina močového měchýře:

Celkový počet studovaných vzorků: Studie prozkoumá mikrobiotu v moči a ve vzorcích tkání, takže každý pacient s rakovinou močového měchýře dá (2 vzorky). Kontrolní skupina podá vzorek moči (jeden vzorek). Nedávný výzkum ukázal, že mikroflóra je detekována v urotelu normálních jedinců a pacientů s rakovinou močového měchýře, tato mikroflóra by se lišila od močové (tekuté) mikroflóry.

Reference:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Mikrobiota související s rakovinou močového měchýře: zkoumání rozdílů ve vzorcích moči a tkání. Sci Rep. 2020 Jul 6;10(1):11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Profilování mikrobioty močového měchýře u pacientů s rakovinou močového měchýře. Přední Microbiol. 7. února 2022;12:718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   Skupina I: Svalová invazivní rakovina močového měchýře, 16 pacientů, 16 pro tkáň močového měchýře a 16 pro vzorky moči. Celkem 32 vzorků. (Studie bude zkoumat mikrobiotu v moči a ve vzorcích tkání, takže každý pacient s rakovinou močového měchýře poskytne (2 vzorky). Kontrolní skupina podá vzorek moči (jeden vzorek). Nedávný výzkum ukázal, že mikroflóra je detekována v urotelu normálních jedinců a pacientů s rakovinou močového měchýře, tato mikroflóra se liší od močové (tekuté) mikroflóry. (Odkazy: ) Skupina II: Svalová invazivní rakovina močového měchýře, 11 pacientů. 22 vzorků 11 pro tkáň močového měchýře a 11 pro vzorky moči získané od stejných pacientů. Skupina III: 11 normálních dospělých: vzorky moči slouží jako kontrolní skupina studie.

   Celkový počet účastníků je 38 jednotlivců.

   Vzorky pro analýzu mikrobiomů:

   Vzorky budou odebírány do čistých nepropustných nádob bez zbytků dezinfekčního prostředku nebo detergentu a s těsně přiléhajícími nepropustnými víčky a uchovávány v chladničce až do analýzy v mikrobiologické laboratoři TBRI.

   Vzorky moči (50 ml) pro analýzu mikrobiomu budou odebrány během cystoskopického vyšetření. Vzorky budou až do zpracování skladovány při -80 °C.

   Vzorky tkání a moči od pacientů s rakovinou močového měchýře: Standardním postupem diagnostické cystoskopie bude odebrán vzorek moči za zcela aseptických podmínek, u pacientů s nádorem močového měchýře bude provedena transuretrální resekce nádoru močového měchýře, bude vyšetřen vzorek tkáně 0,5x0,5 cm pro analýzu mikrobiomů. Vzorky budou až do zpracování skladovány při -80 °C. Histopatologickou diagnostiku hematoxylinem a eosinem provede odborný patolog pro stupeň a stadium nádoru podle WHO 22 a doporučení EAU 2023. Tento postup bude aplikován jak u nesvalově invazivního, tak u svalově invazivního uroteliálního karcinomu. Do velikosti vzorku budou zahrnuti pacienti, kteří podstoupí radikální cystektomii pro karcinom močového měchýře.

   Vzorky pro patologické studie:

   Vzorky tkání budou fixovány formalínem a vyšetřeny hematoxylinem a eosinem.

   Klinické informace Urologové poskytnou adekvátní vzorky tkáně, což je malá část celého resekovaného nádoru nebo část vzorků po cystektomii. pro patologické vyhodnocení s poskytnutím užitečných klinických informací patologovi, aby mohl rozhodnout o nejlepším přístupu k manipulaci a zpracování chirurgických vzorků a vypracovat přesnou patologickou zprávu.

   Urolog upřesní:

   • Demografické údaje a klinická anamnéza pacienta, anamnéza infekce močových cest a pokud byla recidivující nebo sporadická, cytologie močového měchýře, pokud je přítomna, zda se jedná o první projev nádoru, a pokud ne, podrobnosti o předchozí léčbě.
   • Cystoskopický vzhled sliznice močového měchýře a indikují počet, velikost, umístění nádoru/nádorů, morfologické rysy léze: papilární, solidní nebo ulcerózní.
   • Stav zbývající sliznice, pokud byly provedeny další biopsie.

   Tyto informace jsou nezbytné pro správné hodnocení urotelu a vyhledávání v mikrobiomu. Protože léčba může mít dopad na morfologii nádoru a na normálně vypadající urotel.

   Hlášení vzorků rakoviny močového měchýře

   • Patologické vyšetření Patolog určí přítomnost rakoviny močového měchýře a typ rakoviny močového měchýře vyšetřením buněk z biopsie tkáně močového měchýře. Různé typy histologických nádorů rakoviny močového měchýře budou hlášeny podle klasifikace nádorů močového měchýře z roku 2016 (Mazzucchelli et al. 2021), upravené v roce 2022.
   • Mikrobiologické hodnocení: Metody mikrobiální identifikace z moči a tkáně

   Odběr vzorků a podmínky kultivace klinických bakteriálních izolátů:

   Detekce omezeného počtu mikroorganismů, především aerobních a rychle rostoucích bakterií.

   Identifikace bakteriálních izolátů: Izoláty budou identifikovány kultivací na krvi, MacConkeyho agaru a sabaruds agaru, poté budou identifikovány provedením biochemických testů, oxidázového testu mannitolu, žlučového eskulinu a katalázového testu. Všechny izoláty budou identifikovány na úrovni druhu pomocí systému Vitek 2 compact.

   2-5 Hodnocení biochemie a molekulární biologie: 16S Analýza metagenomického sekvenování Na všechny případy bude aplikováno úplné genomové sekvenování (WGS), metodika a kontrola kvality jsou podle genomického a metagenomického centra v dětské onkologické nemocnici 57357, které bude provádět WGS a 16S sekvenování na vzorcích moči a tkání.

1- Izolace DNA z moči a tkáně. Vzorky moči (50 ml) budou rozmraženy a centrifugovány při 7500 g, 4 °C po dobu 10 minut. Peleta bude použita pro extrakci DNA pomocí soupravy Invitrogen™ PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit, provedené podle protokolu výrobce. Aby se zabránilo kontaminaci životního prostředí, budou všechny izolace ze vzorků moči a z kontroly extrakce pouze reagenciemi prováděny v digestoři PCR. Izolované vzorky DNA budou umístěny při -20 °C až do PCR amplifikace. DNA bude kvantifikována pomocí DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Illumina 2013).

2- Kvantifikace knihoven KABA KAPA založené na PCR obsahují všechna činidla potřebná pro přesnou, spolehlivou a reprodukovatelnou kvantifikaci knihoven sekvenování nové generace (NGS) na bázi qPCR připravených pro sekvenování na platformách Illumina. Soupravy zahrnují KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (formulovaný s různými pasivními referenčními barvivy pro různé qPCR přístroje), premix primerů pro kvantifikaci knihovny a předem naředěnou sadu standardů DNA.

Oblast V3-V4 genu 16S rRNA bude amplifikována fúzními primery, které obsahují adaptéry Illumina a indexační čárové kódy. Krok PCR přidává Index 1 (i7) a Index 2 (i5), sekvenování a běžné adaptéry (P5 a P7) potřebné pro generování a sekvenování klastrů. Pro zlepšení kontroly kvality analýzy NGS knihovny bude provedena vysoce citlivá elektroforéza DNA se systémem Bioanalyzer. 3- Příprava genové knihovny 16S rRNA a sekvenování MiSeq. PCR amplifikace 16S rDNA, sekvenování a analýzy budou provedeny pomocí NGS Illumina MiSeq zacílení oblasti V3V4 bakterií MiSeq Reagent Kit v3 (600-cyklus). Sekvenování amplikonu genu 16S rRNA (analýza 16S) se široce používá k analýze mikroflóry pomocí technologií sekvenování nové generace. Data analýzy 16S ze standardních sad primerů V3-V4 (V34) pro optimalizaci protokolu analýzy mikroflóry močového měchýře. 4- Bioinformatika a statistické analýzy. Anotovaný genom je dále analyzován pomocí bioinformatických kanálů, aby se získal pohled na biologii patogenu a potenciál způsobovat onemocnění. To zahrnuje:

- Kontrola kvality a zlepšování návrhu genomu odstraňováním chyb a vyplňováním mezer.

• Anotace konečného genomu, včetně identifikace a popisu funkcí genů a dalších znaků.
• Komparativní genomika, která zahrnuje porovnání nově sekvenovaného genomu s genomy příbuzných patogenů za účelem zjištění rozdílů a podobností.
• Funkční analýza: zahrnuje identifikaci funkcí anotovaných genů a pochopení drah a procesů, kterých se účastní. To může odhalit klíčové faktory virulence a pomoci porozumět mechanismu patogeneze patogenu.
• Fylogenetická analýza: To zahrnuje porovnání nově sekvenovaného genomu s genomem genomu
• souvisejících patogenů k určení evolučních vztahů a sledování šíření patogenů v různých populacích.
• Rozdíly v celkovém mikrobiálním složení mezi rakovinou močového měchýře a zdravými

• vzorky budou posuzovány. NGS není k dispozici v TBRI, sekvenování 16S a bioinformatika budou placeny v dětské nemocnici 57357 (vítáme, že sekvenování provedou na principu „placeno“).

  16S ribozomální RNA (rRNA) Sekvenační analýza

  1. Izolace DNA z moči a tkáně. Vzorky moči (50 ml) budou rozmraženy a centrifugovány při 7500 g, 4 °C po dobu 10 minut. Peleta bude použita pro extrakci DNA pomocí mikrobiomu DNA Purification Kit. Aby se zabránilo kontaminaci životního prostředí, budou všechny izolace ze vzorků moči a z kontroly extrakce pouze reagenciemi prováděny v digestoři PCR. Izolované vzorky DNA budou umístěny při -20 °C až do PCR amplifikace. DNA bude kvantifikována pomocí testovací soupravy (Illumina 2013).
  2. Kvantifikace knihoven KABA KAPA založené na PCR obsahují všechna činidla potřebná pro přesnou, spolehlivou a reprodukovatelnou kvantifikaci knihoven sekvenování nové generace (NGS) na bázi qPCR připravených pro sekvenování na platformách Illumina. Premix primerů pro kvantifikaci knihovny pro platformu a předem zředěná sada standardů DNA.

  Hypervariabilní oblasti 16S rRNA Oblast V1V2 a V3-V4 bude amplifikována fúzními primery, které obsahují adaptéry Illumina a indexační čárové kódy.

Pro zlepšení kontroly kvality analýzy NGS knihovny bude provedena vysoce citlivá elektroforéza DNA se systémem Bioanalyzer.

3- Příprava genové knihovny 16S rRNA a sekvenování MiSeq. PCR amplifikace 16S rRNA, sekvenování a analýzy budou provedeny pomocí NGS Illumina zacílením na oblast V1-V2 a V3-V4. Sekvenování amplikonu genu 16S rRNA (analýza 16S) bude použito k analýze mikroflóry pomocí technologií sekvenování nové generace. Data analýzy 16S ze standardních sad primerů V1-V2, V3-V4 pro optimalizaci protokolu analýzy mikroflóry močového měchýře.

4- Bioinformatika a statistické analýzy. Anotovaný genom je dále analyzován pomocí bioinformatických kanálů, aby se získal pohled na biologii patogenu a potenciál způsobovat onemocnění.

Reference

1. Bučević Popović V, Šitum M, Chow CT, Chan LS, Roje B, Terzić J. Močový mikrobiom spojený s rakovinou močového měchýře. Sci Rep. 2018 Aug 14;8(1):12157. doi: 10.1038/s41598-018-29054-w.
2. Wishahi, M., Otto, T. & Golka, K. Re: Karcinomy močového měchýře u pacientů s neurogenním měchýřem a močovou schistosomiázou-jsou to stejné nádory?. World J Urol 40, 2139-2140 (2022). https://doi.org/10.1007/s00345-022-04076-2
3. Hanan R, Murata M, Ma N, Hammam O, Wishahi M, El Leithy T, Hiraku Y, Oikawa S, Kawanishi S (2012) Nukleární lokalizace COX-2 ve vztahu k expresi stopkových markerů u rakoviny močového měchýře. Mediat Inflamm 2012:165879 2012;2012:165879. doi: 10.1155/2012/165879.
4. Cancrini F, Michel F, Cussenot O, Alshehhi H, Comperat E, Phé V (2022) Karcinomy močového měchýře u pacientů s neurogenním měchýřem a močovou schistosomiázou: jsou to stejné nádory? Svět J Urol. https://doi.org/10.1007/s00345-022-03941-4
5. Hammam O, Wishahi M, Khalil H, El Ganzouri H, Badawy M, Elkhquly A, Elesaily K (2014) Exprese cytokeratinu 7, 20, 14 u uroteliálního karcinomu a spinocelulárního karcinomu egyptského karcinomu močového měchýře. J Egypt Soc Parasitol 44(3):733-740
6. Zitvogel L, Daillère R, Roberti MP, Routy B, Kroemer G. Protirakovinné účinky mikrobiomu a jeho produktů. Nat. Microbiol. 2017;15:109-128. doi: 10.1038/nrmicro.2017.44.
7. Whiteside SA, Razvi H, Dave S, Reid G, Burton JP. Mikrobiom močových cest – role mimo infekci. Nat. Rev. Urol. 2015;12:81-90. doi: 10.1038/nrurol.2014.361.
8. Xu W, a kol. Minirecenze: perspektiva mikrobiomu v patogenezi uroteliálního karcinomu. Dopoledne. J. Clin. Exp. Urol. 2014;2:57-61.
9. Brubaker, L., Gourdine, J.-P. F., Siddiqui, N. Y., Holland, A., Halverson, T., Limeria, R., et al. (2021a). Formování konsenzu pro pokrok ve výzkumu urobiomu. mSystems 6, e0137120. doi: 10.1128/mSystems.01371-20
10. Brubaker, L., Putonti, C., Dong, Q. a Wolfe, A. J. (2021b). Lidský urobiom. Mamm. Genom 32, 232-238. doi: 10.1007/s00335-021-09862-8
11. -Carrasco, V., Soriano-Lerma, A., Soriano, M., J., and Garcia-Salcedo, J. A. (2021). Močový mikrobiom: jin a jang močového traktu. Přední. Buňka. Infikovat. Microbiol. 11. doi: 10.3389/fcimb.2021.617002
12. 43. Wu N, a kol. Podpis dysbiózy fekální mikrobioty u pacientů s kolorektálním karcinomem. Microb. Ecol. 2013;66:462-470. doi: 10.1007/s00248-013-0245-9.