A microbiota na urina e no urotélio pode ser um fator de indução do câncer de bexiga urinária. O estudo examinará a urina e os tecidos do câncer de bexiga de pacientes do sexo masculino e a urina de controles usando técnicas de sequenciamento genômico completo e 16S rRNA. O objetivo é elucidar o papel da microbiota na bexiga (Cancer bladder)

-Racionalidade e objetivos:

A- Câncer de bexiga:

Fundamentação Estima-se que o cancro da bexiga seja a nona doença maligna mais frequente, com 160.000 ou mais mortes por ano estimadas a nível mundial.

Há uma consciência cada vez maior do importante papel dos micróbios que habitam o trato urinário e que desempenham um papel importante na manutenção da saúde e no desenvolvimento de doenças e câncer de bexiga [1].

Existe uma correlação bem estabelecida entre o início do câncer de bexiga e agentes microbianos específicos [2,3,4,5,].

Os danos no ADN do hospedeiro podem ser iniciados directamente através de genotoxinas produzidas por estirpes específicas de E. coli ou através de uma via indirecta, iniciando espécies oxidativas. O microbioma e seus produtos têm efeito anticancerígeno [6].

Tradicionalmente, a urina e o urotélio da bexiga têm sido considerados estéreis em indivíduos saudáveis. Este conceito foi baseado em uroculturas microbiológicas padrão. Recentemente, há provas e evidências acumuladas de que o trato urinário também abriga microrganismos comensais distintos. O microbioma urinário foi relatado em indivíduos saudáveis ​​[7].

O microbioma urinário no câncer de bexiga tem sido raramente investigado; foi relatado que Streptococcus sp foi enriquecido na bexiga de alguns pacientes com câncer de bexiga [8].

Bučević Popović V et al [1] relataram que: "Comunidades bacterianas presentes em amostras de urina de pacientes do sexo masculino com câncer de bexiga e de indivíduos saudáveis ​​foram analisadas usando sequenciamento 16S. Os resultados mostram que o filo mais abundante em ambos os grupos foi Firmicutes, seguido por Actinobacteria, Bacteroidetes e Proteobacteria. Significativamente enriquecido no câncer de bexiga estava o gênero Fusobacterium, que é um possível patógeno protumorigênico. Nos tecidos de câncer de bexiga, as sequências de Fusobacterium nucleatum detectadas por PCR dos gêneros Veillonella, Streptococcus e Corynebacterium foram mais abundantes em urinas saudáveis. Campylobacter hominis foi enriquecido em amostras de urina de pacientes com câncer de bexiga. As espécies de Campylobacter são potencialmente patogênicas, pois produzem toxinas, invadem células epiteliais e podem evitar respostas imunes do hospedeiro".

A microbiota pode fornecer efeitos supressores de tumor ao hospedeiro humano [6]. As tecnologias de sequenciação de próxima geração (NGS) permitiram o perfil de comunidades microbianas em habitats específicos. O sequenciamento do gene 16S ribossômico RNA (rRNA) é usado para o perfil da microbiota com tecnologias NGS. A escolha de qual região hipervariável 16S rRNA sequenciar é crítica nos estudos de perfil da microbiota. Todas as nove regiões hipervariáveis ​​16S rRNA são taxonomicamente informativas, mas devido à variabilidade no desempenho do perfil especificamente, a escolha da região hipervariável 16S rRNA ideal dependerá da composição bacteriana do habitat em estudo. As comunidades microbianas que colonizam o trato urinário (o urobioma) são identificadas em V4, V5. Estudos recentes mostraram que a disbiose do urobioma está ligada a várias condições urológicas [9,10,11] e câncer de bexiga [12].

Objectivos: Portanto, é crucial caracterizar o urobioma na saúde e no cancro da bexiga, podendo levar a novas estratégias de prevenção, diagnóstico e tratamento do cancro da bexiga.

Objetivos O objetivo deste estudo de pesquisa é caracterizar a microbiota urinária de pacientes adultos do sexo masculino com câncer de bexiga e correlacioná-la com a microbiota em controles adultos saudáveis ​​do sexo masculino.

2-Metodologia 2-1 Tipo de estudo: Estudo caso-controle prospectivo 2-2 Inclusão, critérios de exclusão, processo de recrutamento. [os pacientes incluídos no estudo serão solicitados a oferecer um consentimento informado, o Dr. Loay Mostafa e o Dr. Mohamed Sahab do Departamento de Urologia - TBRI serão responsáveis ​​​​por este item].

Critério de inclusão:

• Homens adultos acima de 18 anos,
• Diagnosticado carcinoma de bexiga com ultrassonografia e/ou tomografia computadorizada e citologia urinária.
• Câncer de bexiga confirmado durante cistoscopia diagnóstica, patologia anterior ou exame anatomopatológico das amostras de biópsia.

Critério de exclusão:

• Radioterapia prévia na bexiga ou órgão adjacente.
• Imunoterapia prévia por instilação intravesical com bacilo Calmette-Guérin (BCG), ou instilação intravesical de quimioterápicos.
• Quimioterapia neoadjuvante prévia. Processo de recrutamento Pacientes que cumpram os critérios de exclusão e inclusão. 2-3 Tamanho da amostra Trinta e oito homens egípcios, com idade ≥ 18 anos, serão recrutados no Departamento de Urologia, TBRI de acordo com o cálculo do tamanho da amostra usando software online (Sample Size Calculator). Dez amostras de urina serão coletadas de indivíduos normais.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html O tamanho da amostra será 16 para câncer de bexiga não invasivo muscular (NMIBC). Isso significa que são necessárias 16 ou mais medições/pesquisas para ter um nível de confiança de 95%. O tamanho da amostra será 11 para câncer de bexiga invasivo muscular (MIBC). Isso significa que são necessárias 40 ou mais medições/pesquisas para ter um nível de confiança de 95%. O tamanho da amostra será 11 para o grupo de controle. Isso significa que são necessárias 10 ou mais medições/pesquisas para ter um nível de confiança de 95% A. 38 homens serão recrutados no Departamento de Urologia, TBRI. De acordo com o cálculo do tamanho da amostra utilizando software online (Sample Size Calculator). Onze amostras de urina serão coletadas do tamanho da amostra será 16 para câncer de bexiga não invasivo muscular (NMIBC). Isso significa que são necessárias 16 ou mais medições/pesquisas para ter um nível de confiança de 95% de que o valor real está dentro de ±17,53% do valor medido/pesquisado.

O tamanho da amostra será 11 para câncer de bexiga invasivo muscular (MIBC). Isso significa que são necessárias 11 ou mais medições/pesquisas para ter um nível de confiança de 95% de que o valor real está dentro de ±30,36% do valor medido/pesquisado.

O tamanho da amostra será 11 para o grupo de controle. Isso significa que são necessárias 11 ou mais medições/pesquisas para ter um nível de confiança de 95% de que o valor real está dentro de ±30,36% do valor medido/pesquisado.

indivíduos normais. Esta amostra representa a pesquisa sobre microbioma no câncer de bexiga.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Coleta de amostras

Câncer de bexiga:

O número total de amostras estudadas: O estudo irá explorar a microbiota na urina e em amostras de tecido, portanto cada paciente com câncer de bexiga dará (2 amostras). O grupo controle fornecerá amostra de urina (uma amostra). Pesquisas recentes mostraram que a microbiota é detectada no urotélio de indivíduos normais e pacientes com câncer de bexiga, esta microbiota seria diferente da microbiota da urina (líquida).

Referências:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Microbiota relacionada ao câncer de bexiga: examinando diferenças em amostras de urina e tecido. 2020 6 de julho;10(1):11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Perfil da microbiota da bexiga em pacientes com câncer de bexiga. Microbiol frontal. 7 de fevereiro de 2022;12:718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   Grupo I: Câncer de bexiga não invasivo muscular, 16 pacientes, 16 para tecido de bexiga e 16 para amostras de urina. Total de 32 amostras. (O estudo explorará a microbiota na urina e em amostras de tecido, portanto, cada paciente com câncer de bexiga dará (2 amostras). O grupo controle fornecerá amostra de urina (uma amostra). Pesquisa recente mostrou que a microbiota é detectada no urotélio de indivíduos normais e pacientes com câncer de bexiga, esta microbiota seria diferente da microbiota da urina (líquida). (Referências:) Grupo II: Câncer de bexiga invasivo muscular, 11 pacientes. 22 amostras, 11 de tecido de bexiga e 11 de urina obtidas dos mesmos pacientes. Grupo III: 11 adultos normais: amostras de urina servem como grupo controle do estudo.

   O número total de participantes é de 38 indivíduos.

   Amostras para análise de microbioma:

   As amostras serão coletadas em recipientes limpos e estanques, sem resíduos de desinfetantes ou detergentes e com tampas herméticas e estanques e conservadas em geladeira até serem analisadas no laboratório de microbiologia do TBRI.

   Amostras de urina (50 ml) para análise do microbioma serão coletadas durante exame de cistoscopia. As amostras serão armazenadas a -80 °C até o processamento.

   Amostras de tecido e urina de pacientes com câncer de bexiga: De acordo com o procedimento padrão de cistoscopia diagnóstica, a amostra de urina será coletada sob condições assépticas completas, os pacientes com tumor de bexiga serão submetidos à ressecção transuretral do tumor de bexiga, uma amostra de tecido de 0,5x0,5 cm será investigada para análise de microbioma. As amostras serão armazenadas a -80 °C até o processamento. O diagnóstico histopatológico com coloração de hematoxilina e eosina será feito por um patologista especialista para grau e estágio do tumor de acordo com a OMS 22 e as diretrizes da EAU 2023. Este procedimento será aplicado tanto para carcinoma urotelial não invasivo muscular quanto para carcinoma urotelial invasivo muscular. Pacientes que serão submetidos à cistectomia radical por câncer de bexiga serão incluídos no tamanho da amostra.

   Amostras para estudos patológicos:

   Amostras de tecido serão fixadas com formalina e examinadas com coloração de hematoxilina e eosina.

   Informações clínicas Os urologistas fornecerão amostras de tecido adequadas, que são uma pequena parte de todo o tumor ressecado ou uma parte de amostras de cistectomia. para avaliação patológica, fornecendo informações clínicas úteis ao patologista para decidir a melhor abordagem no manuseio e processamento das peças cirúrgicas e elaborar um relatório anatomopatológico preciso.

   O urologista especificará:

   • Dados demográficos e história clínica do paciente, história de infecção do trato urinário e se foi recorrente ou esporádica, citologia vesical se presente, se é a primeira apresentação do tumor e caso não, detalhes do manejo anterior.
   • A aparência cistoscópica da mucosa da bexiga e indica o número, tamanho, localização do(s) tumor(es), as características morfológicas da lesão: papilar, sólida ou ulcerada.
   • O estado da mucosa remanescente se outras biópsias fossem realizadas.

   Essas informações são necessárias para uma correta avaliação do urotélio e busca no microbioma. Porque os tratamentos podem ter impacto na morfologia do tumor e no urotélio de aspecto normal.

   Relatório de amostras de câncer de bexiga

   • Avaliação patológica O patologista diagnosticará se há câncer de bexiga e o tipo de câncer de bexiga, examinando células da biópsia do tecido da bexiga. Diferentes tipos de tumores histológicos de câncer de bexiga serão relatados de acordo com a classificação de tumores da bexiga urinária da OMS de 2016 (Mazzucchelli et al. 2021), modificada em 2022.
   • Avaliação microbiológica: Métodos de identificação microbiana de urina e tecido

   Coleta de amostras e condições de cultura de isolados bacterianos clínicos:

   Detecção de um número limitado de microrganismos, principalmente bactérias aeróbias e de crescimento rápido.

   Identificação de isolados bacterianos: Os isolados serão identificados por cultura em sangue, ágar MacConkey e ágar sabaruds e em seguida serão identificados por meio de testes bioquímicos, teste de oxidase manitol, esculina biliar e teste de catalase. Todos os isolados serão identificados em nível de espécie usando o sistema compacto Vitek 2.

   2-5 Avaliação de bioquímica e biologia molecular: análise de sequenciamento metagenômico 16S O sequenciamento genômico completo (WGS) será aplicado a todos os casos, a metodologia e o controle de qualidade estão de acordo com o centro genômico e metagenômico do hospital de câncer infantil 57357 que irá realizar o Sequenciamento WGS e 16S em amostras de urina e tecido.

1- Isolamento de DNA de urina e tecido. As amostras de urina (50ml) serão descongeladas e centrifugadas a 7500g, 4°C por 10 minutos. O pellet será usado para extração de DNA usando o kit de purificação de DNA de microbioma Invitrogen™ PureLink™, realizado de acordo com o protocolo do fabricante. Para evitar a contaminação ambiental, todos os isolamentos de amostras de urina e do controle de extração somente com reagentes serão realizados dentro de uma capela de PCR. Amostras isoladas de DNA serão colocadas a -20 °C até a amplificação por PCR. O DNA será quantificado usando o kit de ensaio de alta sensibilidade DeNovix dsDNA (Illumina 2013).

2- Os kits de quantificação de biblioteca KABA KAPA baseados em PCR contêm todos os reagentes necessários para a quantificação precisa, confiável e reprodutível baseada em qPCR de bibliotecas de sequenciamento de próxima geração (NGS) preparadas para sequenciamento em plataformas Illumina. Os kits incluem KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (formulado com diferentes corantes de referência passivos para diferentes instrumentos qPCR), uma pré-mistura de primer de quantificação de biblioteca específica da plataforma e um conjunto pré-diluído de padrões de DNA.

A região V3-V4 do gene 16S rRNA será amplificada com primers de fusão que incorporam adaptadores Illumina e códigos de barras de indexação. A etapa de PCR adiciona Índice 1 (i7) e Índice 2 (i5), sequenciamento e adaptadores comuns (P5 e P7) necessários para geração e sequenciamento de cluster. Eletroforese de DNA de alta sensibilidade com o sistema Bioanalyzer será realizada para melhorar a análise de controle de qualidade da biblioteca NGS. 3- Preparação da biblioteca do gene 16S rRNA e sequenciamento MiSeq. A amplificação por PCR do rDNA 16S, sequenciamento e análises serão realizadas pelo NGS Illumina MiSeq visando a região V3V4 da bactéria MiSeq Reagent Kit v3 (600 ciclos). O sequenciamento do amplicon do gene 16S rRNA (análise 16S) é amplamente utilizado para analisar a microbiota com tecnologias de sequenciamento de próxima geração. Dados de análise 16S dos conjuntos de primers V3-V4 padrão (V34) para otimizar o protocolo de análise da microbiota da bexiga. 4- Bioinformática e análises estatísticas. O genoma anotado é analisado posteriormente usando pipelines de bioinformática para obter insights sobre a biologia do patógeno e o potencial de causar doenças. Inclui:

- Controle de qualidade e melhoria do rascunho do genoma através da remoção de erros e preenchimento de lacunas.

• Anotação do genoma final, incluindo identificação e descrição das funções dos genes e outras características.
• Genômica comparativa, que envolve a comparação do genoma recém-sequenciado com os de patógenos relacionados para identificar diferenças e semelhanças.
• Análise funcional: envolve identificar as funções dos genes anotados e compreender as vias e processos dos quais eles participam. Isto pode revelar fatores-chave de virulência e ajudar a compreender o mecanismo de patogênese do patógeno.
• Análise filogenética: envolve comparar o genoma recém-sequenciado com os de
• patógenos relacionados para determinar relações evolutivas e rastrear a propagação de patógenos em diferentes populações.
• Diferenças na composição microbiana global entre cancro da bexiga e indivíduos saudáveis

• amostras serão avaliadas. NGS não está disponível no TBRI, o sequenciamento 16S e a bioinformática serão feitos pagos no Hospital Infantil 57357 (eles são bem-vindos para realizar o sequenciamento no princípio "Pago").

  Análise de sequenciamento de RNA ribossômico 16S (rRNA)

  1. Isolamento de DNA de urina e tecido. As amostras de urina (50ml) serão descongeladas e centrifugadas a 7500g, 4°C por 10 minutos. O pellet será usado para extração de DNA usando o kit de purificação de DNA de microbioma. Para evitar a contaminação ambiental, todos os isolamentos de amostras de urina e do controle de extração somente com reagentes serão realizados dentro de uma capela de PCR. Amostras de DNA isoladas serão colocadas a -20 °C até a amplificação por PCR. O DNA será quantificado usando um kit de ensaio (Illumina 2013).
  2. Os kits de quantificação de biblioteca KABA KAPA baseados em PCR contêm todos os reagentes necessários para a quantificação precisa, confiável e reprodutível baseada em qPCR de bibliotecas de sequenciamento de próxima geração (NGS) preparadas para sequenciamento em plataformas Illumina. Uma pré-mistura de primers de quantificação de biblioteca específica da plataforma e um conjunto pré-diluído de padrões de DNA.

  As regiões hipervariáveis ​​16S rRNA V1V2 e V3-V4 serão amplificadas com primers de fusão que incorporam adaptadores Illumina e códigos de barras de indexação.

Eletroforese de DNA de alta sensibilidade com o sistema Bioanalyzer será realizada para melhorar a análise de controle de qualidade da biblioteca NGS.

3- Preparação da biblioteca do gene 16S rRNA e sequenciamento MiSeq. A amplificação por PCR de 16S rRNA, sequenciamento e análises serão realizadas pela NGS Illumina visando a região V1-V2 e V3-V4. O sequenciamento do amplicon do gene 16S rRNA (análise 16S) será usado para analisar a microbiota com tecnologias de sequenciamento de próxima geração. Dados de análise 16S dos conjuntos de primers padrão V1-V2, V3-V4 para otimizar o protocolo de análise da microbiota da bexiga.

4- Bioinformática e análises estatísticas. O genoma anotado é analisado posteriormente usando pipelines de bioinformática para obter insights sobre a biologia do patógeno e o potencial de causar doenças.

Referências

1. Bučević Popović V, Šitum M, Chow CT, Chan LS, Roje B, Terzić J. O microbioma urinário associado ao câncer de bexiga. 2018, 14 de agosto;8(1):12157. doi: 10.1038/s41598-018-29054-w.
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