尿液和尿路上皮中的微生物群可能是诱发膀胱癌的一个因素。该研究将使用全基因组测序技术和 16S rRNA 检查男性患者的尿液和膀胱癌组织以及对照者的尿液。目的是阐明微生物群在膀胱中的作用 (Cancer bladder)

-理性和目标：

A- 膀胱癌：

基本原理 膀胱癌估计是第九大最常见的恶性疾病，全球每年估计有 160,000 人或更多死亡。

人们越来越意识到泌尿道中微生物的重要作用，它们在维持健康以及疾病和膀胱癌的发展中发挥着重要作用[1]。

膀胱癌的发生与特定微生物制剂之间存在明确的相关性[2,3,4,5,]。

宿主 DNA 的损伤可以通过特定大肠杆菌菌株产生的基因毒素直接引发，也可以通过引发氧化物质的间接途径引发。 微生物组及其产品具有抗癌作用[6]。

传统上，健康个体的尿液和膀胱尿路上皮被认为是无菌的。 这个概念基于标准微生物尿培养。 最近，越来越多的证据表明泌尿道也含有独特的共生微生物。 健康个体的尿液微生物组已有报道[7]。

膀胱癌中的尿液微生物群很少被研究，有报道称部分膀胱癌患者的膀胱中链球菌属富集[8]。

Bučević Popović V 等人 [1] 报道称：“使用 16S 测序分析了男性膀胱癌患者和健康个体尿液样本中存在的细菌群落。 结果表明，两组中最丰富的门是厚壁菌门，其次是放线菌门、拟杆菌门和变形菌门。 梭杆菌属在膀胱癌中显着富集，它是一种可能的促肿瘤病原体。 在膀胱癌组织中，通过PCR检测到的具核梭杆菌序列，韦荣球菌属、链球菌属和棒状杆菌属在健康尿液中更为丰富。 膀胱癌患者的尿液样本中富含人弯曲杆菌，弯曲杆菌属具有潜在致病性，因为它们会产生毒素，侵入上皮细胞，并且可以避免宿主免疫反应。”

微生物群可能为人类宿主提供肿瘤抑制作用[6]。 新一代测序 (NGS) 技术能够对特定栖息地的微生物群落进行分析。 16S 核糖体 RNA (rRNA) 基因测序用于通过 NGS 技术进行微生物群分析。 在微生物群分析研究中，选择要测序的 16S rRNA 高变区至关重要。 所有九个 16S rRNA 高变区都具有分类学信息，但由于具体分析性能存在差异，选择理想的 16S rRNA 高变区将取决于所研究栖息地的细菌组成。 在 V4、V5 中鉴定出定植于泌尿道（尿生物组）的微生物群落。 最近的研究表明，尿生态失调与多种泌尿系统疾病 [9,10,11] 和膀胱癌有关 [12]。

目的：因此，表征健康和膀胱癌中的尿生物组至关重要，并可能为膀胱癌带来新的预防、诊断和治疗策略。

目的 本研究的目的是表征成年男性膀胱癌患者的尿液微生物群，并与健康成年男性对照的微生物群相关。

2-方法 2-1 研究类型：前瞻性病例对照研究 2-2 纳入、排除标准、招募过程。 [纳入研究的患者将被要求提供知情同意书，泌尿科的 Loay Mostafa 博士和 Mohamed Sahab 博士 - TBRI 将负责此项]。

纳入标准：

• 18岁以上成年男性，
• 通过超声成像和/或计算机断层扫描以及尿细胞学诊断膀胱癌。
• 在诊断性膀胱镜检查、既往病理学或活检标本病理检查过程中确诊膀胱癌。

排除标准：

• 先前对膀胱或邻近器官进行过放射治疗。
• 既往接受过卡介苗（BCG）膀胱内灌注免疫治疗，或膀胱内灌注化疗药物。
• 既往新辅助化疗。 招募过程 满足排除和纳入标准的患者。 2-3 样本量 TBRI泌尿外科根据在线软件（样本量计算器）计算样本量，招募38名年龄≥18岁的埃及男性。 将从正常人身上采集十份尿液样本。

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 非肌层浸润性膀胱癌 (NMIBC) 的样本量为 16 个。 这意味着需要 16 次或更多测量/调查才能达到 95% 的置信度。 肌层浸润性膀胱癌 (MIBC) 的样本量为 11 个。 这意味着需要 40 次或更多测量/调查才能达到 95% 的置信度。 对照组的样本量为 11。 这意味着需要 10 次或更多测量/调查才能达到 95% A 的置信水平。 TBRI 泌尿外科将招募 38 名男性。 根据样本量计算使用在线软件（Sample Size Calculator）。 将采集 11 份尿液样本 对于非肌层浸润性膀胱癌 (NMIBC)，样本量为 16。 这意味着需要 16 次或更多测量/调查才能获得 95% 的置信度，即真实值在测量/调查值的 ±17.53% 范围内。

肌层浸润性膀胱癌 (MIBC) 的样本量为 11 个。 这意味着需要进行 11 次或更多测量/调查才能获得 95% 的置信度，即真实值在测量/调查值的 ±30.36% 范围内。

对照组的样本量为 11。 这意味着需要进行 11 次或更多测量/调查才能获得 95% 的置信度，即真实值在测量/调查值的 ±30.36% 范围内。

正常人。 该样本代表了膀胱癌微生物组的研究。

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 样本采集

膀胱癌：

研究样本总数：该研究将探索尿液和组织样本中的微生物群，因此每位膀胱癌患者都会给出（2 个样本）。 对照组将提供尿液样本（一份）。 最近的研究表明，在正常人和膀胱癌患者的尿路上皮中检测到微生物群，该微生物群与尿液（液体）微生物群不同。

参考：

1. Mansour B、Monyók Á、Makra N、Gajdács M、Vadnay I、Ligeti B、Juhász J、Szabó D、Ostorházi E. 膀胱癌相关微生物群：检查尿液和组织样本的差异。 《科学报告》2020 年 7 月 6 日；10(1):11042。 DOI：10.1038/s41598-020-67443-2。

2. Parra-Grande M、Oré-Arce M、Martínez-Priego L、D'Auria G、Rosselló-Mora R、Lillo M、Sempere A、Lumbreras B、Sánchez-Hellín V。膀胱癌患者膀胱微生物群分析。 前面的微生物。 2022 年 2 月 7 日；12:718776。 DOI：10.3389/fmicb.2021.718776。

   第一组：非肌层浸润性膀胱癌，16名患者，16名膀胱组织，16名尿液样本。 总共 32 个样本。 （该研究将探索尿液和组织样本中的微生物群，因此每位膀胱癌患者都会提供（2 个样本）。 对照组将提供尿液样本（一份）。 最近的研究表明，在正常人和膀胱癌患者的尿路上皮中检测到微生物群，该微生物群与尿液（液体）微生物群不同。（参考文献：）第二组：肌层浸润性膀胱癌，11名患者。 22 个样本，其中 11 个为膀胱组织样本，11 个为尿液样本，均取自同一患者。 第三组：11名正常成人：尿液样本作为研究的对照组。

   参加者总数为38人。

   用于微生物组分析的样品：

   样品将被收集在干净的防漏容器中，没有消毒剂或清洁剂残留，并带有紧密的防漏盖，并保存在冰箱中，直到在TBRI微生物实验室进行分析。

   在膀胱镜检查期间将收集尿液样本（50 毫升）用于微生物组分析。 样品将在-80°C 下储存直至处理。

   膀胱癌患者的组织和尿液样本：根据诊断性膀胱镜检查的标准程序，将在完全无菌的条件下收集尿液样本，患有膀胱肿瘤的患者将接受经尿道膀胱肿瘤切除术，将研究0.5x0.5厘米的组织样本用于微生物组分析。 样品将在-80°C 下储存直至处理。 由病理学专家根据 WHO 22 和 EAU 指南 2023 对肿瘤分级和分期进行苏木精和伊红染色的组织病理学诊断。 该手术将适用于非肌肉浸润性和肌肉浸润性尿路上皮癌。 因膀胱癌接受根治性膀胱切除术的患者将被纳入样本量。

   病理研究样本：

   组织样本将用福尔马林固定并用苏木精和伊红染色进行检查。

   临床信息 泌尿科医生将提供足够的组织样本，这些样本是整个切除肿瘤的一小部分或膀胱切除标本的一部分。 用于病理评估，为病理学家提供有用的临床信息，以决定处理和处理手术标本的最佳方法，并起草准确的病理报告。

   泌尿科医生将指定：

   • 患者的人口统计数据和临床病史、尿路感染史以及是否复发或散发、膀胱细胞学检查（如果存在）、是否是肿瘤的首次表现、如果不是，则先前治疗的详细信息。
   • 膀胱粘膜的膀胱镜外观并显示肿瘤的数量、大小、位置、病变的形态特征：乳头状、实性或溃疡状。
   • 如果进行进一步的活检，则剩余粘膜的状态。

   这些信息对于正确评估尿路上皮和搜索微生物组是必要的。 因为治疗会对肿瘤形态和正常的尿路上皮产生影响。

   膀胱癌样本报告

   • 病理评估 病理学家将通过检查膀胱组织活检的细胞来诊断是否存在膀胱癌以及膀胱癌的类型。 膀胱癌的不同组织学肿瘤类型将根据 2016 年 WHO 膀胱肿瘤分类（Mazzucchelli 等人，2021 年）进行报告，并于 2022 年进行了修改。
   • 微生物学评估：尿液和组织中的微生物鉴定方法

   临床分离菌样本采集及培养条件：

   检测有限数量的微生物，主要是需氧和快速生长的细菌。

   分离菌的鉴定：通过血液、麦康凯琼脂和沙巴鲁德琼脂培养来鉴定分离菌，然后通过生化试验、氧化酶试验甘露醇、胆汁七叶苷和过氧化氢酶试验来鉴定。 所有分离株将通过使用 Vitek 2 紧凑系统进行物种水平鉴定。

   2-5 生物化学和分子生物学评估：16S宏基因组测序分析 所有病例均采用全基因组测序（WGS），方法和质量控制根据儿童癌症医院基因组和宏基因组中心进行，57357对尿液和组织样本进行 WGS 和 16S 测序。

1- 从尿液和组织中分离 DNA。 将尿液样本（50ml）解冻并在 7500g、4°C 下离心 10 分钟。 该沉淀将用于使用 Invitrogen™ PureLink™ 微生物组 DNA 纯化试剂盒进行 DNA 提取，根据制造商的方案进行。 为了避免环境污染，尿液样本和纯试剂提取控制的所有分离都将在 PCR 罩内进行。 分离的 DNA 样品将置于 -20°C 直至 PCR 扩增。 将使用 DeNovix dsDNA 高灵敏度检测试剂盒 (Illumina 2013) 对 DNA 进行定量。

基于 2-PCR 的 KABA KAPA 文库定量试剂盒包含对下一代测序 (NGS) 文库进行准确、可靠和可重复的基于 qPCR 的定量所需的所有试剂，这些文库是为在 Illumina 平台上进行测序而准备的。 试剂盒包括 KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix（针对不同 qPCR 仪器使用不同的被动参比染料配制）、平台特定的文库定量引物预混物以及一组预稀释的 DNA 标准品。

16S rRNA 基因 V3-V4 区域将使用包含 Illumina 接头和索引条形码的融合引物进行扩增。 PCR 步骤添加了簇生成和测序所需的索引 1 (i7) 和索引 2 (i5)、测序以及通用接头（P5 和 P7）。 将使用 Bioanalyzer 系统进行高灵敏度 DNA 电泳，以提高 NGS 文库的质量控制分析。 3- 16S rRNA基因文库制备和MiSeq测序。 16S rDNA 的 PCR 扩增、测序和分析将通过针对细菌 MiSeq Reagent Kit v3（600 个循环）的 V3V4 区域的 NGS Illumina MiSeq 进行。 16S rRNA 基因扩增子测序（16S 分析）广泛用于利用下一代测序技术分析微生物群。 来自标准 V3-V4 引物 (V34) 组的 16S 分析数据，用于优化膀胱微生物群分析方案。 4- 生物信息学和统计分析。 使用生物信息学管道进一步分析带注释的基因组，以深入了解病原体的生物学和引起疾病的可能性。 这包括：

- 通过消除错误和填补空白来控制和改进基因组草案。

• 最终基因组的注释，包括识别和描述基因的功能和其他特征。
• 比较基因组学，涉及将新测序的基因组与相关病原体的基因组进行比较，以确定差异和相似之处。
• 功能分析：这涉及识别注释基因的功能并了解它们参与的途径和过程。 这可以揭示关键的毒力因子，有助于了解病原体的发病机制。
• 系统发育分析：这涉及将新测序的基因组与
• 相关病原体以确定进化关系并跟踪病原体在不同群体中的传播。
• 膀胱癌与健康人群总体微生物组成的差异

• 将评估样品。 TBRI不提供NGS，16S测序和生物信息学将在57357儿童医院付费进行（欢迎他们按照“付费”原则进行测序）。

  16S核糖体RNA (rRNA)测序分析

  1. 从尿液和组织中分离 DNA。 将尿液样本（50ml）解冻并在 7500g、4°C 下离心 10 分钟。 沉淀物将用于使用微生物 DNA 纯化试剂盒提取 DNA。 为了避免环境污染，尿液样本和纯试剂提取控制的所有分离都将在 PCR 罩内进行。 分离的 DNA 样本将置于 -20 °C 直至 PCR 扩增。 DNA 将使用检测试剂盒 (Illumina 2013) 进行定量。
  2. 基于 PCR 的 KABA KAPA 文库定量试剂盒包含对下一代测序 (NGS) 文库进行准确、可靠和可重复的基于 qPCR 的定量所需的所有试剂，这些文库是为在 Illumina 平台上进行测序而准备的。 特定于平台的文库定量引物预混物和一组预稀释的 DNA 标准品。

  16S rRNA 高变区 V1V2 和 V3-V4 区将使用包含 Illumina 接头和索引条形码的融合引物进行扩增。

将使用 Bioanalyzer 系统进行高灵敏度 DNA 电泳，以提高 NGS 文库的质量控制分析。

3- 16S rRNA基因文库制备和MiSeq测序。 16S rRNA 的 PCR 扩增、测序和分析将由针对 V1-V2 和 V3-V4 区域的 NGS Illumina 进行。 16S rRNA 基因扩增子测序（16S 分析）将用于通过下一代测序技术分析微生物群。 来自标准 V1-V2、V3-V4 引物组的 16S 分析数据，用于优化膀胱微生物群分析方案。

4- 生物信息学和统计分析。 使用生物信息学管道进一步分析带注释的基因组，以深入了解病原体的生物学和引起疾病的可能性。

参考

1. Bučević Popović V、Šitum M、Chow CT、Chan LS、Roje B、Terzić J. 泌尿微生物组与膀胱癌相关。 科学报告，2018 年 8 月 14 日；8(1):12157。 doi：10.1038/s41598-018-29054-w。
2. Wishahi, M.、Otto, T. 和 Golka, K. Re：神经源性膀胱和尿路血吸虫病患者的膀胱癌 - 它们是相同的肿瘤吗？ 世界泌尿杂志 40, 2139-2140 (2022)。 https://doi.org/10.1007/s00345-022-04076-2
3. Hanan R、Murata M、Ma N、Hammam O、Wishahi M、El Leithy T、Hiraku Y、Oikawa S、Kawanishi S (2012) COX-2 的核定位与膀胱癌干性标记物表达的关系。 介质炎症 2012：165879 2012；2012：165879。 DOI：10.1155/2012/165879。
4. Cancrini F, Michel F, Cussenot O, Alshehhi H, Comperat E, Phé V (2022) 神经源性膀胱和尿路血吸虫病患者的膀胱癌：它们是相同的肿瘤吗？ 世界泌尿杂志。 https://doi.org/10.1007/s00345-022-03941-4
5. Hammam O、Wishahi M、Khalil H、El Ganzouri H、Badawy M、Elkhquly A、Elesaily K (2014) 细胞角蛋白 7、20、14 在埃及膀胱癌的尿路上皮癌和鳞状细胞癌中的表达。 J 埃及 Soc Parasitol 44(3):733-740
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