Le microbiote dans l'urine et l'urothélium peut être un facteur d'induction du cancer de la vessie. L'étude examinera les tissus cancéreux de l'urine et de la vessie de patients masculins et l'urine de témoins à l'aide de techniques de séquençage génomique entier et d'ARNr 16S. L'objectif est d'élucider le rôle du microbiote dans la vessie (Cancer bladder)

-Rationnelle et objectifs :

A- Cancer de la vessie :

Justification On estime que le cancer de la vessie est la neuvième maladie maligne la plus fréquente, avec 160 000 décès ou plus par an dans le monde.

On prend de plus en plus conscience du rôle important des microbes qui habitent dans les voies urinaires et qui jouent un rôle important dans le maintien de la santé et le développement de maladies et de cancer de la vessie [1].

Il existe une corrélation bien établie entre l'initiation du cancer de la vessie et des agents microbiens spécifiques [2,3,4,5,].

Les dommages à l'ADN de l'hôte pourraient être directement initiés via des génotoxines produites par des souches spécifiques d'E. coli ou via une voie indirecte en initiant des espèces oxydantes. Le microbiome et ses produits ont un effet anticancéreux [6].

Traditionnellement, l’urine et l’urothélium de la vessie sont considérés comme stériles chez les individus en bonne santé. Ce concept était basé sur des cultures d’urine microbiologiques standards. Récemment, de plus en plus de preuves indiquent que les voies urinaires abritent également des micro-organismes commensaux distincts. Le microbiome urinaire a été rapporté chez des individus sains [ 7].

Le microbiome urinaire dans le cancer de la vessie a été peu étudié ; il a été rapporté que Streptococcus sp était enrichi dans la vessie de certains patients atteints d'un cancer de la vessie [8].

Bučević Popović V et al [1] ont rapporté que : « Les communautés bactériennes présentes dans les échantillons d'urine de patients de sexe masculin atteints d'un cancer de la vessie et d'individus en bonne santé ont été analysées à l'aide du séquençage 16S. Les résultats montrent que le phylum le plus abondant dans les deux groupes était celui des Firmicutes, suivi des Actinobactéries, des Bacteroidetes et des Protéobactéries. Le genre Fusobacterium, qui est un possible agent pathogène protumorigène, a été considérablement enrichi dans le cancer de la vessie. Dans les tissus cancéreux de la vessie, les séquences de Fusobacterium nucleatum détectées par PCR des genres Veillonella, Streptococcus et Corynebacterium étaient plus abondantes dans les urines saines. Campylobacter hominis a été enrichi dans des échantillons d'urine de patients atteints d'un cancer de la vessie. Les espèces de Campylobacter sont potentiellement pathogènes car elles produisent des toxines, envahissent les cellules épithéliales et peuvent éviter les réponses immunitaires de l'hôte".

Le microbiote peut avoir des effets suppresseurs de tumeurs sur l’hôte humain [6]. Les technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) ont permis le profilage des communautés microbiennes dans des habitats spécifiques. Le séquençage du gène de l’ARN ribosomal 16S (ARNr) est utilisé pour le profilage du microbiote avec les technologies NGS. Le choix de la région hypervariable de l’ARNr 16S à séquencer est essentiel dans les études de profilage du microbiote. Les neuf régions hypervariables d'ARNr 16S sont informatives sur le plan taxonomique, mais en raison de la variabilité des performances de profilage spécifiquement, le choix de la région hypervariable d'ARNr 16S idéale dépendra de la composition bactérienne de l'habitat étudié. Les communautés microbiennes colonisant les voies urinaires (l'urobiome) sont identifiées en V4,V5. Des études récentes ont montré que la dysbiose de l'urobiome est liée à plusieurs affections urologiques [9,10,11] et au cancer de la vessie [12].

Objectifs : Il est donc crucial de caractériser l’urobiome dans le domaine de la santé et du cancer de la vessie, et pourrait conduire à de nouvelles stratégies de prévention, de diagnostic et de traitement du cancer de la vessie.

Objectifs Le but de cette étude de recherche est de caractériser le microbiote urinaire des patients adultes de sexe masculin atteints d'un cancer de la vessie et d'être corrélé avec le microbiote chez des hommes adultes en bonne santé témoins.

2-Méthodologie 2-1 Type d'étude : Étude cas-témoins prospective 2-2 Inclusion, critères d'exclusion, processus de recrutement. [Les patients inclus dans l'étude seront invités à offrir un consentement éclairé, le Dr Loay Mostafa et le Dr Mohamed Sahab du service d'urologie - TBRI seront responsables de cet élément].

Critère d'intégration:

• Hommes adultes de plus de 18 ans,
• Diagnostic de carcinome de la vessie par échographie d'imagerie et/ou tomodensitométrie et cytologie urinaire.
• Cancer de la vessie confirmé soit lors d'une cystoscopie diagnostique, d'une pathologie antérieure ou d'un examen pathologique des échantillons de biopsie.

Critère d'exclusion:

• Radiothérapie antérieure de la vessie ou d'un organe adjacent.
• Immunothérapie par instillation intravésicale antérieure avec le bacille de Calmette-Guérin (BCG), ou instillation intravésicale de produits chimiothérapeutiques.
• Chimiothérapie néoadjuvante antérieure. Processus de recrutement Patients remplissant les critères d'exclusion et d'inclusion. 2-3 Taille de l'échantillon Trente-huit hommes égyptiens, âgés de ≥ 18 ans, seront recrutés au département d'urologie du TBRI selon le calcul de la taille de l'échantillon à l'aide d'un logiciel en ligne (Sample Size Calculator). Dix échantillons d'urine seront prélevés sur des individus normaux.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html La taille de l'échantillon sera de 16 pour le cancer de la vessie non invasif sur le plan musculaire (NMIBC). Cela signifie qu'au moins 16 mesures/enquêtes sont nécessaires pour avoir un niveau de confiance de 95 %. La taille de l'échantillon sera de 11 pour le cancer de la vessie invasif musculaire (MIBC). Cela signifie qu'au moins 40 mesures/enquêtes sont nécessaires pour avoir un niveau de confiance de 95 %. La taille de l'échantillon sera de 11 pour le groupe témoin. Cela signifie que 10 mesures/enquêtes ou plus sont nécessaires pour avoir un niveau de confiance de 95 % A. 38 hommes seront recrutés au service d'urologie du TBRI. Selon le calcul de la taille de l'échantillon à l'aide d'un logiciel en ligne (Sample Size Calculator). Onze échantillons d'urine seront collectés à partir de la taille de l'échantillon sera de 16 pour le cancer de la vessie non invasif sur le plan musculaire (NMIBC). Cela signifie qu'au moins 16 mesures/enquêtes sont nécessaires pour avoir un niveau de confiance de 95 % que la valeur réelle se situe à ±17,53 % de la valeur mesurée/étudiée.

La taille de l'échantillon sera de 11 pour le cancer de la vessie invasif musculaire (MIBC). Cela signifie qu'au moins 11 mesures/enquêtes sont nécessaires pour avoir un niveau de confiance de 95 % que la valeur réelle se situe à ± 30,36 % de la valeur mesurée/étudiée.

La taille de l'échantillon sera de 11 pour le groupe témoin. Cela signifie qu'au moins 11 mesures/enquêtes sont nécessaires pour avoir un niveau de confiance de 95 % que la valeur réelle se situe à ± 30,36 % de la valeur mesurée/étudiée.

des individus normaux. Cet échantillon représente la recherche sur le microbiome dans le cancer de la vessie.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Prélèvement d'échantillons

Cancer de la vessie:

Le nombre total d'échantillons étudiés : L'étude explorera le microbiote dans l'urine et dans des échantillons de tissus, donc chaque patient atteint d'un cancer de la vessie donnera (2 échantillons). Le groupe témoin donnera un échantillon d'urine (un échantillon). Des recherches récentes ont montré que le microbiote est détecté dans l'urothélium des individus normaux et des patients atteints d'un cancer de la vessie, ce microbiote serait différent du microbiote urinaire (liquide).

Les références:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Microbiote lié au cancer de la vessie : examen des différences dans les échantillons d'urine et de tissus. Sci Rep. 6 juillet 2020;10(1):11042. est ce que je: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Profilage du microbiote de la vessie chez les patients atteints d'un cancer de la vessie. Microbiol avant. 7 février 2022;12:718776. est ce que je: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   Groupe I : Cancer de la vessie non invasif sur le plan musculaire, 16 patients, 16 pour les tissus de la vessie et 16 pour les échantillons d'urine. Total 32 échantillons. (L'étude explorera le microbiote dans l'urine et dans des échantillons de tissus, donc chaque patient atteint d'un cancer de la vessie donnera (2 échantillons). Le groupe témoin donnera un échantillon d'urine (un échantillon). Des recherches récentes ont montré que le microbiote est détecté dans l'urothélium d'individus normaux et de patients atteints d'un cancer de la vessie, ce microbiote serait différent du microbiote urinaire (liquide). (Références : ) Groupe II : Cancer de la vessie invasif musculaire, 11 patients. 22 échantillons, 11 pour les tissus de la vessie et 11 pour les échantillons d'urine obtenus auprès des mêmes patients. Groupe III : 11 adultes normaux : les échantillons d'urine de servent de groupe témoin de l'étude.

   Le nombre total de participants est de 38 personnes.

   Échantillons pour analyse du microbiome :

   Les échantillons seront collectés dans des récipients propres et étanches sans résidus de désinfectant ou de détergent et avec des couvercles étanches bien ajustés et conservés au réfrigérateur jusqu'à leur analyse au laboratoire de microbiologie du TBRI.

   Des échantillons d'urine (50 ml) pour l'analyse du microbiome seront collectés lors de l'examen de cystoscopie. Les échantillons seront conservés à -80 °C jusqu'au traitement.

   Échantillons de tissus et d'urine de patients atteints d'un cancer de la vessie : selon la procédure standard de cystoscopie diagnostique, un échantillon d'urine sera collecté dans des conditions d'asepsie complète, les patients atteints d'une tumeur de la vessie subiront une résection transurétrale de la tumeur de la vessie, un échantillon de tissu de 0,5 x 0,5 cm sera étudié pour l’analyse du microbiome. Les échantillons seront conservés à -80 °C jusqu'au traitement. Le diagnostic histopathologique avec la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine sera effectué par un pathologiste expert pour le grade et le stade de la tumeur selon les directives de l'OMS 22 et de l'EAU 2023. Cette procédure sera appliquée à la fois au carcinome urothélial non invasif musculaire et invasif musculaire. Les patients qui subiront une cystectomie radicale pour un cancer de la vessie seront inclus dans la taille de l'échantillon.

   Échantillons pour études pathologiques :

   Les échantillons de tissus seront fixés avec du formol et examinés avec une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine.

   Informations cliniques Les urologues fourniront des échantillons de tissus adéquats, qui constituent une petite partie de l'ensemble de la tumeur réséquée ou une partie des échantillons de cystectomie. pour l'évaluation pathologique en donnant des informations cliniques utiles au pathologiste pour décider de la meilleure approche de manipulation et de traitement des échantillons chirurgicaux et rédiger un rapport de pathologie précis.

   L'urologue précisera :

   • Données démographiques et antécédents cliniques du patient, antécédents d'infection des voies urinaires et si elle était récurrente ou sporadique, cytologie de la vessie si présente, s'il s'agit de la première présentation de la tumeur et sinon, détails de la prise en charge antérieure.
   • L'aspect cystoscopique de la muqueuse vésicale indique le nombre, la taille, la localisation de la ou des tumeurs, les caractéristiques morphologiques de la lésion : papillaire, solide ou ulcérée.
   • L'état de la muqueuse restante si d'autres biopsies étaient réalisées.

   Ces informations sont nécessaires pour une évaluation correcte de l’urothélium et une recherche dans le microbiome. Parce que les traitements peuvent avoir un impact sur la morphologie tumorale et sur l’urothélium d’apparence normale.

   Déclaration d’échantillons de cancer de la vessie

   • Évaluation pathologique Le pathologiste diagnostiquera la présence d'un cancer de la vessie et le type de cancer de la vessie, en examinant les cellules de la biopsie des tissus de la vessie. Différents types de tumeurs histologiques du cancer de la vessie seront rapportés selon la classification OMS 2016 des tumeurs de la vessie (Mazzucchelli et al. 2021), modifiée en 2022.
   • Évaluation microbiologique : méthodes d'identification microbienne à partir de l'urine et des tissus

   Conditions de prélèvement d’échantillons et de culture d’isolats bactériens cliniques :

   Détection d'un nombre limité de micro-organismes, principalement des bactéries aérobies et à croissance rapide.

   Identification des isolats bactériens : Les isolats seront identifiés par culture sur sang, gélose MacConkey et gélose sabaruds puis seront identifiés en effectuant des tests biochimiques, test oxydase mannitol, bile esculine et test catalase. Tous les isolats seront identifiés au niveau de l'espèce à l'aide du système compact Vitek 2.

   2-5 Évaluation de la biochimie et de la biologie moléculaire : analyse du séquençage métagénomique 16S Le séquençage génomique entier (WGS) sera appliqué à tous les cas, la méthodologie et le contrôle de qualité sont conformes au centre de génomique et métagénomique de l'hôpital du cancer pour enfants 57357 qui va effectuer le Séquençage WGS et 16S sur des échantillons d’urine et de tissus.

1- Isolement de l'ADN de l'urine et des tissus. Les échantillons d'urine (50 ml) seront décongelés et centrifugés à 7 500 g, 4 °C pendant 10 minutes. Le culot sera utilisé pour l'extraction de l'ADN à l'aide du kit de purification de l'ADN du microbiome Invitrogen™ PureLink™, réalisée selon le protocole du fabricant. Pour éviter toute contamination de l'environnement, tous les isolements des échantillons d'urine et du contrôle d'extraction des réactifs uniquement seront effectués sous une hotte PCR. Les échantillons d'ADN isolés seront placés à -20 °C jusqu'à l'amplification PCR. L'ADN sera quantifié à l'aide du kit de test DeNovix dsDNA High Sensitivity (Illumina 2013).

2- Les kits de quantification de bibliothèque KABA KAPA basés sur PCR contiennent tous les réactifs nécessaires à la quantification précise, fiable et reproductible basée sur qPCR des bibliothèques de séquençage de nouvelle génération (NGS) préparées pour le séquençage sur les plateformes Illumina. Les kits comprennent le KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (formulé avec différents colorants de référence passifs pour différents instruments qPCR), un prémélange d'amorces de quantification de bibliothèque spécifique à la plate-forme et un ensemble pré-dilué d'étalons d'ADN.

La région V3-V4 du gène ARNr 16S sera amplifiée avec des amorces de fusion intégrant des adaptateurs Illumina et des codes-barres d'indexation. L'étape PCR ajoute l'index 1 (i7) et l'index 2 (i5), le séquençage et les adaptateurs communs (P5 et P7) requis pour la génération et le séquençage du cluster. Une électrophorèse d'ADN à haute sensibilité avec le système Bioanalyzer sera réalisée pour améliorer l'analyse de contrôle qualité de la bibliothèque NGS. Préparation d'une bibliothèque de gènes d'ARNr 3- 16S et séquençage MiSeq. L'amplification PCR de l'ADNr 16S, le séquençage et les analyses seront effectués par NGS Illumina MiSeq ciblant la région V3V4 de la bactérie MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycles). Le séquençage des amplicons du gène de l’ARNr 16S (analyse 16S) est largement utilisé pour analyser le microbiote avec les technologies de séquençage de nouvelle génération. Données d'analyse 16S provenant des ensembles d'amorces standard V3-V4 (V34) pour optimiser le protocole d'analyse du microbiote de la vessie. 4- Bioinformatique et analyses statistiques. Le génome annoté est ensuite analysé à l'aide de pipelines bioinformatiques pour mieux comprendre la biologie de l'agent pathogène et son potentiel à provoquer une maladie. Il comprend:

- Contrôle qualité et amélioration du projet de génome en supprimant les erreurs et en comblant les lacunes.

• Annotation du génome final, y compris l'identification et la description des fonctions des gènes et d'autres caractéristiques.
• Génomique comparative, qui consiste à comparer le génome nouvellement séquencé à celui d'agents pathogènes apparentés afin d'identifier les différences et les similitudes.
• Analyse fonctionnelle : il s'agit d'identifier les fonctions des gènes annotés et de comprendre les voies et processus auxquels ils participent. Cela peut révéler des facteurs de virulence clés et aider à comprendre le mécanisme de pathogenèse de l'agent pathogène.
• Analyse phylogénétique : elle consiste à comparer le génome nouvellement séquencé à ceux de
• agents pathogènes apparentés pour déterminer les relations évolutives et suivre la propagation des agents pathogènes dans différentes populations.
• Différences dans la composition microbienne globale entre les personnes atteintes d’un cancer de la vessie et celles en bonne santé

• les échantillons seront évalués. NGS n'est pas disponible au TBRI, le séquençage 16S et la bioinformatique seront effectués contre rémunération à l'hôpital pour enfants 57357 (ils sont invités à effectuer le séquençage selon un principe « payant »).

  Analyse de séquençage de l'ARN ribosomal 16S (ARNr)

  1. Isolement de l'ADN de l'urine et des tissus. Les échantillons d'urine (50 ml) seront décongelés et centrifugés à 7 500 g, 4 °C pendant 10 minutes. Le culot sera utilisé pour l'extraction de l'ADN à l'aide du kit de purification de l'ADN du microbiome. Pour éviter toute contamination de l'environnement, tous les isolements des échantillons d'urine et du contrôle d'extraction des réactifs uniquement seront effectués sous une hotte PCR. Les échantillons d'ADN isolés seront placés à -20 °C jusqu'à l'amplification PCR. L'ADN sera quantifié à l'aide d'un kit de test (Illumina 2013).
  2. Les kits de quantification de bibliothèque KABA KAPA basés sur PCR contiennent tous les réactifs nécessaires à la quantification précise, fiable et reproductible basée sur qPCR des bibliothèques de séquençage de nouvelle génération (NGS) préparées pour le séquençage sur les plateformes Illumina. Un prémélange d'amorces de quantification de bibliothèque spécifique à la plate-forme et un ensemble pré-dilué d'étalons d'ADN.

  Régions hypervariables de l'ARNr 16S Les régions V1V2 et V3-V4 seront amplifiées avec des amorces de fusion intégrant des adaptateurs Illumina et des codes-barres d'indexation.

Une électrophorèse d'ADN à haute sensibilité avec le système Bioanalyzer sera réalisée pour améliorer l'analyse de contrôle qualité de la bibliothèque NGS.

Préparation d'une bibliothèque de gènes d'ARNr 3- 16S et séquençage MiSeq. L'amplification PCR de l'ARNr 16S, le séquençage et les analyses seront effectués par NGS Illumina ciblant les régions V1-V2 et V3-V4. Le séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S (analyse 16S) sera utilisé pour analyser le microbiote avec des technologies de séquençage de nouvelle génération. Données d'analyse 16S provenant des ensembles d'amorces standards V1-V2, V3-V4 pour optimiser le protocole d'analyse du microbiote vésical.

4- Bioinformatique et analyses statistiques. Le génome annoté est ensuite analysé à l'aide de pipelines bioinformatiques pour mieux comprendre la biologie de l'agent pathogène et son potentiel à provoquer une maladie.

Les références

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