Mikrobiota i urin och urothelium kan vara en faktor för induktion av urinblåsecancer. Studien kommer att undersöka urin- och blåscancervävnader från manliga patienter och urin från kontroller med hjälp av hela genomiska sekvenseringstekniker och 16S rRNA. Syftet är att belysa mikrobiotans roll i urinblåsan (Cancer bladder)

-Rationellt och mål:

A- Cancer i urinblåsan:

Bakgrund Blåscancer uppskattas vara den nionde vanligaste maligna sjukdomen, med 160 000 eller fler dödsfall per år uppskattade globalt.

Det finns en allt större medvetenhet om den viktiga roll som mikrober som lever i urinvägarna spelar en viktig roll för att upprätthålla hälsan och utvecklingen av sjukdomar och cancer i urinblåsan [1].

Det finns en väletablerad korrelation mellan initiering av blåscancer och specifika mikrobiella medel [2,3,4,5,].

Skada på värd-DNA kan initieras direkt via genotoxiner producerade av specifika E. coli-stammar eller via en indirekt väg genom att initiera oxidativa arter. Microbiome och dess produkter har en anticancereffekt [6].

Traditionellt har urin och urinblåsa urotel ansetts sterila hos friska individer. Detta koncept baserades på standard mikrobiologiska urinkulturer. Nyligen finns det samlade bevis och bevis för att urinvägarna också hyser distinkta kommensala mikroorganismer. Urinmikrobiomet har rapporterats hos friska individer [7].

Urinmikrobiomet i blåscancer har sällan undersökts, det hade rapporterats att Streptococcus sp anrikades i urinblåsan hos vissa patienter med blåscancer [8].

Bučević Popović V et al [1] rapporterade att: "Bakteriesamhällen som finns i urinprover från manliga patienter med blåscancer och från friska individer analyserades med 16S-sekvensering. Resultaten visar att den vanligaste phylumen i båda grupperna var Firmicutes, följt av Actinobacteria, Bacteroidetes och Proteobacteria. Betydligt berikat i blåscancern var släktet Fusobacterium, som är en möjlig protumorogen patogen. I blåscancervävnader var Fusobacterium nucleatum-sekvenser detekterade med PCR, släktena Veillonella, Streptococcus och Corynebacterium, vanligare i friska uriner. Campylobacter hominis berikades i urinprover från patienter med blåscancer, Campylobacter-arter är potentiellt patogena eftersom de producerar toxiner, invaderar epitelceller och kan undvika värdimmunsvar".

Mikrobiota kan ge tumörhämmande effekter till den mänskliga värden [6]. Nästa generations sekvenseringsteknik (NGS) har möjliggjort profilering av mikrobiella samhällen i specifika livsmiljöer. 16S ribosomalt RNA (rRNA) gensekvensering används för mikrobiotaprofilering med NGS-teknologier. Att välja vilken 16S rRNA hypervariabel region som ska sekvenseras är avgörande i mikrobiotaprofileringsstudier är viktigt. Alla nio 16S rRNA hypervariabla regioner är taxonomiskt informativa, men på grund av variation i profileringsprestanda för specifikt kommer valet av den idealiska 16S rRNA hypervariabla regionen att bero på bakteriesammansättningen av livsmiljön som studeras. Mikrobiella samhällen som koloniserar urinvägarna (urobiomet) identifieras i V4,V5. Nyligen genomförda studier har visat att urobiom dysbios är kopplat till flera urologiska tillstånd [9,10,11] och cancer i urinblåsan [12].

Mål: Därför är det avgörande att karakterisera urobiomet i hälsa och blåscancer, och kan leda till nya förebyggande, diagnostiska och behandlingsstrategier för blåscancer.

Syfte Syftet med denna forskningsstudie är att karakterisera urinmikrobiotan hos vuxna manliga patienter med blåscancer och att korreleras med mikrobiota hos friska vuxna manliga kontroller.

2-Metodologi 2-1 Studietyp: Prospektiv fallkontrollstudie 2-2 Inklusion, uteslutningskriterier, rekryteringsprocess. [inkluderade patienter i studien kommer att uppmanas att ge ett informerat samtycke, Dr Loay Mostafa och Dr. Mohamed Sahab från urologiska avdelningen - TBRI kommer att ansvara för detta objekt].

Inklusionskriterier:

• Vuxna män över 18 år,
• Diagnostiserats av cancer i urinblåsan med ultraljudsundersökning och/eller datoriserad tomografi och urincytologi.
• Bekräftad blåscancer antingen under diagnostisk cystoskopi, tidigare patologi eller patologisk undersökning av biopsiproverna.

Exklusions kriterier:

• Tidigare strålbehandling mot urinblåsan eller till intilliggande organ.
• Tidigare intravesikal instillation av immunterapi med bacillus Calmette-Guérin (BCG), eller intravesikal instillation av kemoterapeutika.
• Tidigare neoadjuvant kemoterapi. Rekryteringsprocess Patienter som uppfyller uteslutnings- och inklusionskriterierna. 2-3 Provstorlek Trettioåtta egyptiska män, ålder ≥ 18 år, kommer att rekryteras vid Institutionen för urologi, TBRI enligt provstorleksberäkning med hjälp av onlineprogramvara (Sample Size Calculator). Tio urinprover kommer att tas från normala individer.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html Provstorleken kommer att vara 16 för icke-muskelinvasiv blåscancer (NMIBC). Det betyder att 16 eller fler mätningar/undersökningar behövs för att ha en konfidensnivå på 95 %. Provstorleken kommer att vara 11 för muskelinvasiv blåscancer (MIBC). Det betyder att 40 eller fler mätningar/undersökningar behövs för att ha en konfidensnivå på 95 %. Provstorleken kommer att vara 11 för kontrollgruppen. Det betyder att 10 eller fler mätningar/enkäter behövs för att ha en konfidensnivå på 95 % A. 38 män kommer att rekryteras vid Institutionen för urologi, TBRI. Enligt provstorleksberäkning med hjälp av onlineprogramvara (Sample Size Calculator). Elva urinprover kommer att samlas in från Provstorleken kommer att vara 16 för icke-muskelinvasiv blåscancer (NMIBC). Det betyder att 16 eller fler mätningar/undersökningar behövs för att ha en konfidensnivå på 95 % för att det verkliga värdet ligger inom ±17,53 % av det uppmätta/undersökta värdet.

Provstorleken kommer att vara 11 för muskelinvasiv blåscancer (MIBC). Det betyder att 11 eller fler mätningar/undersökningar behövs för att ha en konfidensnivå på 95 % för att det verkliga värdet är inom ±30,36 % av det uppmätta/undersökta värdet.

Provstorleken kommer att vara 11 för kontrollgruppen. Det betyder att 11 eller fler mätningar/undersökningar behövs för att ha en konfidensnivå på 95 % för att det verkliga värdet är inom ±30,36 % av det uppmätta/undersökta värdet.

normala individer. Detta prov representerar forskningen om mikrobiom vid cancer i urinblåsan.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 Provsamling

Blåscancer:

Det totala antalet studerade prover: Studien kommer att utforska mikrobiotan i urin och i vävnadsprover, så varje patient med cancer i urinblåsan kommer att ge (2 prover). Kontrollgruppen kommer att ge urinprov (ett prov). Ny forskning visade att mikrobiota detekteras i urothelium hos normala individer och patienter med blåscancer, denna mikrobiota skulle skilja sig från urin(flytande) mikrobiota.

Referenser:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. Blåscancerrelaterad mikrobiota: undersökning av skillnader i urin- och vävnadsprover. Sci Rep. 2020 Jul 6;10(1):11042. doi: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. Profilering av blåsmikrobiotan hos patienter med cancer i urinblåsan. Främre Microbiol. 2022 7 februari;12:718776. doi: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   Grupp I: Icke-muskelinvasiv blåscancer, 16 patienter, 16 för blåsvävnad och 16 för urinprover. Totalt 32 prover. (Studien kommer att utforska mikrobiotan i urin och i vävnadsprover, så varje patient med blåscancer kommer att ge (2 prover). Kontrollgruppen kommer att ge urinprov (ett prov). Ny forskning visade att mikrobiota detekteras i urothelium hos normala individer och patienter med blåscancer, denna mikrobiota skulle skilja sig från urin(flytande) mikrobiota.(Referenser: ) Grupp II: Muskelinvasiv blåscancer, 11 patienter. 22 prover 11 för blåsvävnad och 11 för urinprov erhållna från samma patienter. Grupp III: 11 Normala vuxna: urinprov från fungerar som kontrollgrupp för studien.

   Totalt antal deltagare är 38 individuella.

   Prover för mikrobiomanalys:

   Prover kommer att samlas in i rena läckagesäkra behållare utan rester av desinfektionsmedel eller rengöringsmedel och med tättslutande läckagesäkra lock och förvaras i kylskåp tills de analyseras vid TBRI:s mikrobiologiska laboratorium.

   Urinprover (50 ml) för mikrobiomanalys kommer att samlas in under cystoskopiundersökning. Proverna kommer att förvaras vid -80 °C fram till bearbetning.

   Vävnads- och urinprover från patienter med blåscancer: Under standardprocedur för diagnostisk cystoskopi kommer urinprov att samlas in under fullständiga aseptiska förhållanden, patienter som har blåstumör kommer att genomgå transuretral resektion av blåstumör, ett vävnadsprov 0,5x0,5 cm kommer att undersökas för mikrobiomanalys. Proverna kommer att förvaras vid -80 °C fram till bearbetning. Histopatologisk diagnos med hematoxylin- och eosinfärgning kommer att göras av en expertpatolog för tumörgrad och stadium enligt WHO 22 och EAU:s riktlinjer 2023. Denna procedur kommer att tillämpas för både icke-muskelinvasivt och muskelinvasivt urotelialt karcinom. Patienter som ska genomgå radikal cystektomi för blåscancer kommer att inkluderas i urvalsstorleken.

   Prover för patologiska studier:

   Vävnadsprover fixeras med formalin och undersöks med hematoxylin och eosinfärgning.

   Klinisk information Urologerna kommer att tillhandahålla adekvata vävnadsprover som är en liten del av hela den resekerade tumören eller en del av cystektomiprover. för patologisk utvärdering med att ge användbar klinisk information till patologen för att bestämma det bästa tillvägagångssättet vid hantering och bearbetning av de kirurgiska proverna och upprätta en noggrann patologirapport.

   Urologen kommer att specificera:

   • Demografiska data och patientens kliniska historia, anamnes på urinvägsinfektion och om den var återkommande eller sporadisk, blåscytologi om det finns, om det är den första presentationen av tumören och om inte, detaljer om tidigare behandling.
   • Det cystoskopiska utseendet av blåslemhinnan och indikerar antal, storlek, placering av tumören/tumörerna, de morfologiska egenskaperna hos lesionen: papillär, solid eller ulcerös.
   • Tillståndet för kvarvarande slemhinna om ytterligare biopsier utfördes.

   Dessa uppgifter är nödvändiga för en korrekt utvärdering av urotel och sökning i mikrobiom. Eftersom behandlingarna kan ha en inverkan på tumörmorfologin och på normalt utseende urothelium.

   Rapportering av blåscancerprover

   • Patologisk bedömning Patologen kommer att diagnostisera om en blåscancer är närvarande och vilken typ av blåscancer, genom att undersöka celler från blåsvävnadsbiopsi. Olika histologiska tumörtyper av blåscancer kommer att rapporteras enligt 2016 års WHO-klassificering av urinblåstumörer (Mazzucchelli et al. 2021), modifierad 2022.
   • Mikrobiologisk bedömning: Mikrobiella identifieringsmetoder från urin och vävnad

   Provtagnings- och odlingsförhållanden för kliniska bakterieisolat:

   Detektion av ett begränsat antal mikroorganismer, främst aeroba och snabbväxande bakterier.

   Identifiering av bakterieisolat: Isolaten kommer att identifieras genom odling på blod, MacConkey-agar och sabaruds-agar och kommer sedan att identifieras genom att utföra biokemiska tester, oxidastest mannitol, galleskulin och katalastest. Alla isolat kommer att identifieras till artnivå genom att använda Vitek 2 kompaktsystem.

   2-5 Biokemi och molekylärbiologisk bedömning: 16S Metagenomic Sequencing Analys Helgenomisk sekvensering (WGS) kommer att tillämpas på alla fall, metodik och kvalitetskontroll är enligt det genomiska och metagenomiska centret på barncancersjukhuset 57357 som ska utföra WGS- och 16S-sekvensering på urin- och vävnadsprover.

1- DNA-isolering från urin och vävnad. Urinprover (50 ml) kommer att tinas och centrifugeras vid 7500g, 4°C i 10 minuter. Pelleten kommer att användas för DNA-extraktion med Invitrogen™ PureLink™ Microbiome DNA Purification Kit, utfört enligt tillverkarens protokoll. För att undvika miljöförorening kommer alla isoleringar från urinprover och från extraktionskontrollen för endast reagens att utföras i en PCR-huv. Isolerade DNA-prover kommer att placeras vid -20 °C fram till PCR-amplifkation. DNA kommer att kvantifieras med hjälp av DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Illumina 2013).

2-PCR-baserade KABA KAPA Library Quantification Kits innehåller alla reagenser som behövs för korrekt, pålitlig och reproducerbar qPCR-baserad kvantifiering av nästa generations sekvenseringsbibliotek (NGS) förberedda för sekvensering på Illumina-plattformar. Kit inkluderar KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (formulerad med olika passiva referensfärgämnen för olika qPCR-instrument), en plattformsspecifik bibliotekskvantifieringsprimerpremix och en förutspädd uppsättning DNA-standarder.

16S rRNA-genens V3-V4-region kommer att förstärkas med fusionsprimrar som innehåller Illumina-adaptrar och indexerande streckkoder. PCR-steget lägger till Index 1 (i7) och Index 2 (i5), sekvensering och gemensamma adaptrar (P5 och P7) som krävs för klustergenerering och sekvensering. Högkänslig DNA-elektrofores med Bioanalyzer-systemet kommer att göras för att förbättra kvalitetskontrollanalysen av NGS-biblioteket. 3- 16S rRNA-genbiblioteksberedning och MiSeq-sekvensering. PCR-amplifiering av 16S rDNA, sekvensering och analyser kommer att utföras av NGS Illumina MiSeq riktad mot V3V4-regionen av bakterier MiSeq Reagent Kit v3 (600-cykel). 16S rRNA-genamplikonsekvensering (16S-analys) används i stor utsträckning för att analysera mikrobiota med nästa generations sekvenseringsteknologier. 16S analysdata från standard V3-V4 primer (V34) set för att optimera urinblåsan mikrobiota analysprotokoll. 4- Bioinformatik och statistiska analyser. Det kommenterade genomet analyseras vidare med hjälp av bioinformatiska pipelines för att få insikter i patogenens biologi och potential för att orsaka sjukdom. Det inkluderar:

- Kvalitetskontroll och förbättring av utkastet genom att ta bort fel och fylla i luckor.

• Annotering av det slutliga genomet, inklusive identifiering och beskrivning av funktionerna hos gener och andra egenskaper.
• Jämförande genomik, som innebär att jämföra det nyligen sekvenserade genomet med det från relaterade patogener för att identifiera skillnader och likheter.
• Funktionsanalys: detta innebär att identifiera funktionerna hos de kommenterade generna och förstå de vägar och processer de deltar i. Detta kan avslöja viktiga virulensfaktorer och hjälpa till att förstå patogenens patogenesmekanism.
• Fylogenetisk analys: Detta innebär att jämföra det nyligen sekvenserade genomet med det från
• relaterade patogener för att fastställa evolutionära samband och spåra spridningen av patogener i olika populationer.
• Skillnader i den övergripande mikrobiella sammansättningen mellan cancer i urinblåsan och frisk

• prover kommer att bedömas. NGS är inte tillgängligt i TBRI, 16S-sekvensering och bioinformatik kommer att göras betald på Children Hospital 57357 (de är välkomna att utföra sekvenseringen enligt en "betald"-princip).

  16S ribosomalt RNA (rRNA) Sekvensanalys

  1. DNA-isolering från urin och vävnad. Urinprover (50 ml) kommer att tinas och centrifugeras vid 7500g, 4°C i 10 minuter. Pelleten kommer att användas för DNA-extraktion med mikrobiom DNA Purification Kit. För att undvika miljöförorening kommer alla isoleringar från urinprover och från extraktionskontrollen för endast reagens att utföras i en PCR-huv. Isolerade DNA-prover kommer att placeras vid -20 °C fram till PCR-amplifiering. DNA kommer att kvantifieras med hjälp av ett analyskit (Illumina 2013).
  2. PCR-baserade KABA KAPA Library Quantification Kits innehåller alla reagenser som behövs för korrekt, pålitlig och reproducerbar qPCR-baserad kvantifiering av nästa generations sekvenseringsbibliotek (NGS) förberedda för sekvensering på Illumina-plattformar. En plattformsspecifik bibliotekskvantifieringsprimerpremix och en förutspädd uppsättning DNA-standarder.

  16S rRNA hypervariabla regionerV1V2 och V3-V4 regioner kommer att förstärkas med fusionsprimrar som innehåller Illumina-adaptrar och indexerande streckkoder.

Högkänslig DNA-elektrofores med Bioanalyzer-systemet kommer att göras för att förbättra kvalitetskontrollanalysen av NGS-biblioteket.

3- 16S rRNA-genbiblioteksberedning och MiSeq-sekvensering. PCR-amplifiering av 16S rRNA, sekvensering och analyser kommer att utföras av NGS Illumina som riktar in sig på V1-V2- och V3-V4-regionerna. 16S rRNA-genamplikonsekvensering (16S-analys) kommer att användas för att analysera mikrobiota med nästa generations sekvenseringsteknologier. 16S analysdata från standard V1-V2, V3-V4 primer set för att optimera urinblåsan mikrobiota analysprotokoll.

4- Bioinformatik och statistiska analyser. Det kommenterade genomet analyseras vidare med hjälp av bioinformatiska pipelines för att få insikter i patogenens biologi och potential för att orsaka sjukdom.

Referenser

1. Bučević Popović V, Šitum M, Chow CT, Chan LS, Roje B, Terzić J. Urinmikrobiomet associerat med cancer i urinblåsan. Sci Rep. 2018 Aug 14;8(1):12157. doi: 10.1038/s41598-018-29054-w.
2. Wishahi, M., Otto, T. & Golka, K. Re: blåskarcinom hos patienter med neurogen urinblåsa och urinschistosomiasis - är de samma tumörer?. World J Urol 40, 2139-2140 (2022). https://doi.org/10.1007/s00345-022-04076-2
3. Hanan R, Murata M, Ma N, Hammam O, Wishahi M, El Leithy T, Hiraku Y, Oikawa S, Kawanishi S (2012) Nukleär lokalisering av COX-2 i förhållande till uttrycket av stamnessmarkörer i urinblåscancer. Mediat Inflamm 2012:165879 2012;2012:165879. doi: 10.1155/2012/165879.
4. Cancrini F, Michel F, Cussenot O, Alshehhi H, Comperat E, Phé V (2022) Blåskarcinom hos patienter med neurogen urinblåsa och urinschistosomiasis: är det samma tumörer? Världen J Urol. https://doi.org/10.1007/s00345-022-03941-4
5. Hammam O, Wishahi M, Khalil H, El Ganzouri H, Badawy M, Elkhquly A, Elesaily K (2014) Uttryck av cytokeratin 7, 20, 14 i uroteliala karcinom och skivepitelcancer i den egyptiska urinblåscancern. J Egypt Soc Parasitol 44(3):733-740
6. Zitvogel L, Daillère R, Roberti MP, Routy B, Kroemer G. Anticancereffekter av mikrobiomet och dess produkter. Nat. Rev. Microbiol. 2017;15:109-128. doi: 10.1038/nrmicro.2017.44.
7. Whiteside SA, Razvi H, Dave S, Reid G, Burton JP. Mikrobiomet i urinvägarna - en roll bortom infektion. Nat. Rev. Urol. 2015;12:81-90. doi: 10.1038/nrurol.2014.361.
8. Xu W, et al. Minirecension: perspektiv på mikrobiomet i patogenesen av urotelialt karcinom. Am. J. Clin. Exp. Urol. 2014;2:57-61.
9. Brubaker, L., Gourdine, J.-P. F., Siddiqui, N. Y., Holland, A., Halverson, T., Limeria, R., et al. (2021a). Bildar konsensus för att främja urobiomforskning. mSystems 6, e0137120. doi: 10.1128/mSystems.01371-20
10. Brubaker, L., Putonti, C., Dong, Q. och Wolfe, A. J. (2021b). Det mänskliga urobiomet. Mamma. Genome 32, 232-238. doi: 10.1007/s00335-021-09862-8
11. -Carrasco, V., Soriano-Lerma, A., Soriano, M., J. och Garcia-Salcedo, J.A. (2021). Urinmikrobiom: Yin och Yang i urinvägarna. Främre. Cell. Infektera. Microbiol. 11. doi: 10.3389/fcimb.2021.617002
12. 43. Wu N, et al. Dysbiossignatur av fekal mikrobiota hos patienter med kolorektal cancer. Microb. Ecol. 2013;66:462-470. doi: 10.1007/s00248-013-0245-9.