소변과 요로상피의 미생물군은 요로 방광암을 유발하는 요인이 될 수 있습니다. 이 연구에서는 전체 게놈 서열 분석 기술과 16S rRNA를 사용하여 남성 환자의 소변 및 방광암 조직과 대조군의 소변을 검사합니다. 목표는 방광에서 미생물총의 역할을 밝히는 것입니다. (Cancer bladder)

-합리성과 목적:

A- 방광암:

근거 방광암은 아홉 번째로 흔한 악성 질환으로 추산되며, 전 세계적으로 연간 160,000명 이상의 사망자가 발생하는 것으로 추산됩니다.

요로에 서식하며 건강 유지, 질병 및 방광암 발병에 중요한 역할을 하는 미생물의 중요성에 대한 인식이 점차 높아지고 있습니다[1].

방광암의 시작과 특정 미생물 작용제 사이에는 잘 확립된 상관관계가 있습니다[2,3,4,5,].

숙주 DNA의 손상은 특정 대장균 균주에 의해 생성된 유전독소를 통해 직접적으로 시작되거나 산화성 종을 시작하여 간접적인 경로를 통해 시작될 수 있습니다. 마이크로바이옴과 그 제품은 항암 효과가 있습니다 [6].

전통적으로 건강한 사람의 소변과 방광 요로 상피는 무균 상태로 간주되었습니다. 이 개념은 표준 미생물학적 소변 배양을 기반으로 했습니다. 최근에는 요로에도 뚜렷한 공생 미생물이 존재한다는 누적된 증거와 증거가 있습니다. 비뇨기 미생물군집은 건강한 개인에게서 보고되었습니다[7].

방광암의 요로 미생물군집은 드물게 조사되었으며, 일부 방광암 환자의 방광에 Streptococcus sp가 풍부하다는 보고가 있었습니다[8].

Bučević Popović V 등은 다음과 같이 보고했습니다. "남성 방광암 환자와 건강한 개인의 소변 표본에 존재하는 박테리아 군집을 16S 서열 분석을 사용하여 분석했습니다. 결과는 두 그룹 모두에서 가장 풍부한 문은 피르미쿠테스(Firmicutes)이고, 악티노박테리아(Actinobacteria), 박테로이데테스(Bacteroidetes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria)가 그 뒤를 잇는다는 것을 보여줍니다. 방광암에는 잠재적인 원종양 병원체인 Fusobacterium 속이 상당히 풍부했습니다. 방광암 조직에서는 PCR로 검출된 Fusobacterium nucleatum 서열인 Veillonella, Streptococcus 및 Corynebacterium 속이 건강한 소변에서 더 풍부했습니다. 캄필로박터 호미니스(Campylobacter hominis)는 방광암 환자의 소변 샘플에 풍부하게 들어 있으며, 캄필로박터 종은 독소를 생성하고 상피 세포를 침범하며 숙주 면역 반응을 피할 수 있기 때문에 병원성이 있을 수 있습니다."

미생물군은 인간 숙주에게 종양 억제 효과를 제공할 수 있습니다[6]. 차세대 염기서열 분석(NGS) 기술을 통해 특정 서식지에서 미생물 군집의 프로파일링이 가능해졌습니다. 16S 리보솜 RNA(rRNA) 유전자 서열 분석은 NGS 기술을 사용한 미생물군 프로파일링에 사용됩니다. 미생물군 프로파일링 연구에서는 어떤 16S rRNA 초가변 영역을 선택하여 서열 분석하는 것이 중요합니다. 9개의 16S rRNA 초가변 영역은 모두 분류학적으로 유익하지만, 특히 프로파일링 성능의 가변성으로 인해 이상적인 16S rRNA 초가변 영역을 선택하는 것은 연구 중인 서식지의 박테리아 구성에 따라 달라집니다. 요로(유로바이옴)에 서식하는 미생물 군집은 V4,V5에서 확인됩니다. 최근 연구에 따르면 유로바이옴 세균 불균형은 여러 비뇨기과적 질환[9,10,11] 및 방광암[12]과 관련이 있는 것으로 나타났습니다.

목표: 따라서 건강과 방광암에서 유로바이옴을 특성화하는 것이 중요하며 방광암에 대한 새로운 예방, 진단 및 치료 전략으로 이어질 수 있습니다.

목표 본 연구의 목적은 방광암이 있는 성인 남성 환자의 요로 미생물의 특성을 파악하고 건강한 성인 남성 대조군의 미생물과 상관 관계를 파악하는 것입니다.

2-방법론 2-1 연구 유형: 전향적 사례 관리 연구 2-2 포함, 제외 기준, 모집 프로세스. [ 연구에 포함된 환자는 사전 동의를 제공하도록 요청받을 것이며 비뇨기과의 Dr. Loay Mostafa 및 Dr. Mohamed Sahab - TBRI가 이 항목을 담당할 것입니다].

포함 기준:

• 18세 이상의 성인 남성,
• 영상 초음파 검사 및/또는 컴퓨터 단층 촬영 및 소변 세포검사를 통해 방광암종을 진단합니다.
• 진단 방광경 검사, 이전 병리 또는 생검 표본의 병리학 검사 중에 방광암이 확인되었습니다.

제외 기준:

• 방광이나 인접 기관에 대한 이전 방사선 치료.
• 이전에 BCG(Calmette-Guérin) 간균을 이용한 방광 내 주입 면역요법 또는 화학요법제의 방광 내 주입.
• 이전 신보강 화학요법. 모집 프로세스 제외 및 포함 기준을 충족하는 환자. 2-3 표본 크기 18세 이상의 이집트 남성 38명이 온라인 소프트웨어(표본 크기 계산기)를 사용한 표본 크기 계산에 따라 TBRI 비뇨기과에서 모집됩니다. 10개의 소변 샘플이 정상인으로부터 수집됩니다.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 비근육 침습성 방광암(NMIBC)의 경우 표본 크기는 16명입니다. 즉, 95%의 신뢰도를 얻으려면 16회 이상의 측정/설문조사가 필요합니다. 근육 침습성 방광암(MIBC)의 경우 표본 크기는 11입니다. 즉, 95%의 신뢰 수준을 얻으려면 40회 이상의 측정/설문조사가 필요합니다. 대조군의 경우 표본 크기는 11입니다. 이는 95% A의 신뢰 수준을 갖기 위해 10회 이상의 측정/설문조사가 필요하다는 것을 의미합니다. TBRI 비뇨기과에서 38명의 남성을 모집할 것입니다. 온라인 소프트웨어(샘플 크기 계산기)를 사용한 샘플 크기 계산에 따름. 비근육 침습성 방광암(NMIBC)의 경우 샘플 크기는 16개입니다. 이는 실제 값이 측정/조사된 값의 ±17.53% 내에 있다는 95%의 신뢰 수준을 갖기 위해서는 16회 이상의 측정/설문이 필요함을 의미합니다.

근육 침습성 방광암(MIBC)의 경우 표본 크기는 11입니다. 이는 실제 값이 측정/조사된 값의 ±30.36% 내에 있다는 95%의 신뢰 수준을 갖기 위해서는 11번 이상의 측정/설문이 필요하다는 것을 의미합니다.

대조군의 경우 표본 크기는 11입니다. 이는 실제 값이 측정/조사된 값의 ±30.36% 내에 있다는 95%의 신뢰 수준을 갖기 위해서는 11번 이상의 측정/설문이 필요하다는 것을 의미합니다.

정상적인 개인. 이 샘플은 방광암의 미생물군집에 대한 연구를 나타냅니다.

https://www.calculator.net/sample-size-calculator.html 2-4 시료채취

방광암:

연구된 총 샘플 수: 이 연구에서는 소변과 조직 샘플의 미생물군을 탐색하므로 모든 방광암 환자에게 2개의 샘플이 제공됩니다. 대조군은 소변 샘플(1회)을 제공합니다. 최근 연구에 따르면 미생물군은 정상인과 방광암 환자의 요로상피에서 검출되며, 이 미생물군은 소변(액체) 미생물군과 다를 수 있습니다.

참고자료:

1. Mansour B, Monyók Á, Makra N, Gajdács M, Vadnay I, Ligeti B, Juhász J, Szabó D, Ostorházi E. 방광암 관련 미생물군: 소변과 조직 샘플의 차이 조사. Sci Rep. 2020 7월 6;10(1):11042. 도이: 10.1038/s41598-020-67443-2.

2. Parra-Grande M, Oré-Arce M, Martínez-Priego L, D'Auria G, Rosselló-Mora R, Lillo M, Sempere A, Lumbreras B, Sánchez-Hellín V. 방광암 환자의 방광 미생물 프로파일링. 프론트 미생물. 2022년 2월 7일;12:718776. 도이: 10.3389/fmicb.2021.718776.

   그룹 I: 비근육 침습성 방광암, 16명의 환자, 방광 조직의 경우 16명, 소변 샘플의 경우 16명. 총 32개의 샘플. (이 연구에서는 소변과 조직 샘플의 미생물군을 조사할 예정이므로 모든 방광암 환자는 2개의 샘플을 제공하게 됩니다. 대조군은 소변 샘플(1회)을 제공합니다. 최근 연구에 따르면 정상인과 방광암 환자의 요로상피에서 미생물군이 검출되는 것으로 나타났습니다. 이 미생물군은 소변(액체) 미생물군과 다를 것입니다.(참고 자료: ) 그룹 II: 근육 침습성 방광암, 11명의 환자. 동일한 환자로부터 얻은 방광 조직용 샘플 11개와 소변 샘플용 11개 샘플 22개. 그룹 III: 11명의 정상 성인: 소변 샘플이 연구의 대조군 역할을 합니다.

   총 참가자 수는 38명입니다.

   미생물군집 분석을 위한 샘플:

   샘플은 소독제나 세제 잔여물이 없고 누출 방지 뚜껑이 꼭 맞는 깨끗한 누출 방지 용기에 수집되어 TBRI 미생물학 실험실에서 분석될 때까지 냉장고에 보관됩니다.

   미생물군집 분석을 위한 소변 샘플(50ml)은 방광경 검사 중에 수집됩니다. 샘플은 처리될 때까지 -80°C에서 보관됩니다.

   방광암 환자의 조직 및 소변 샘플: 진단 방광경 검사의 표준 절차에 따라 완전 무균 조건에서 소변 샘플을 수집하고, 방광 종양이 있는 환자는 방광 종양의 경요도 절제술을 받고, 0.5x0.5cm 크기의 조직 샘플을 조사합니다. 마이크로바이옴 분석을 위해 샘플은 처리될 때까지 -80°C에서 보관됩니다. 헤마톡실린 및 에오신 염색을 이용한 조직병리학적 진단은 WHO 22 및 EAU 지침 2023에 따라 종양 등급 및 단계에 대해 전문 병리학자가 수행합니다. 이 절차는 비근육 침습성 및 근육 침습성 요로상피암종 모두에 적용됩니다. 방광암으로 인해 근치 방광절제술을 받을 환자도 표본 크기에 포함됩니다.

   병리학 연구용 샘플:

   조직 샘플은 포르말린으로 고정되고 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 검사됩니다.

   임상 정보 비뇨기과 전문의는 절제된 전체 종양의 일부 또는 방광절제술 표본의 일부인 적절한 조직 샘플을 제공합니다. 병리학자에게 유용한 임상 정보를 제공하여 병리학적 평가를 통해 수술 표본을 처리하고 처리하는 데 있어 최선의 접근 방식을 결정하고 정확한 병리학 보고서를 작성합니다.

   비뇨기과 전문의는 다음을 지정합니다.

   • 환자의 인구통계학적 데이터 및 임상 이력, 요로 감염의 이력, 재발성 또는 산발성인 경우 방광 세포검사, 종양의 첫 번째 발현 여부, 그렇지 않은 경우 이전 관리의 세부사항.
   • 방광 점막의 방광경 모양은 종양의 수, 크기, 위치, 병변의 형태학적 특징(유두상, 고형 또는 궤양)을 나타냅니다.
   • 추가 생검을 실시한 경우 남은 점막 상태.

   이러한 정보는 요로상피의 정확한 평가와 미생물군집 검색에 필요합니다. 치료가 종양 형태와 정상적으로 보이는 요로 상피에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다.

   방광암 샘플 보고

   • 병리학적 평가 병리의사는 방광 조직 생검을 통해 세포를 검사하여 방광암의 존재 여부와 방광암의 유형을 진단합니다. 방광암의 다양한 조직학적 종양 유형은 2022년에 수정된 2016년 WHO 요로 방광 종양 분류(Mazzucchelli et al. 2021)에 따라 보고될 것입니다.
   • 미생물학적 평가: 소변 및 조직에서 미생물 식별 방법

   임상 세균 분리물의 샘플 수집 및 배양 조건:

   제한된 수의 미생물, 주로 호기성 및 빠르게 자라는 박테리아를 검출합니다.

   분리균의 동정: 분리균은 혈액, MacConkey 한천, 사바루드 한천에서 배양하여 동정한 후 생화학적 시험, 산화효소 시험 만니톨, 담즙 에스쿨린, 카탈라제 시험을 실시하여 동정합니다. 모든 분리물은 Vitek 2 컴팩트 시스템을 사용하여 종 수준으로 식별됩니다.

   2-5 생화학 및 분자 생물학 평가: 16S Metagenomic Sequencing 분석 모든 사례에 WGS(Whole genomic sequencing)를 적용할 예정이며, 방법론 및 품질 관리는 수행할 소아암병원 57357의 유전체 및 메타게놈 센터에 따릅니다. 소변 및 조직 샘플에 대한 WGS 및 16S 시퀀싱.

1- 소변과 조직에서 DNA 분리. 소변 검체(50ml)를 해동하고 7500g, 4°C에서 10분간 원심분리합니다. 펠렛은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되는 Invitrogen™ PureLink™ Microbiome DNA 정제 키트를 사용하여 DNA 추출에 사용됩니다. 환경 오염을 방지하기 위해 소변 샘플과 시약 전용 추출 컨트롤의 모든 분리는 PCR 후드 내에서 수행됩니다. 분리된 DNA 샘플은 PCR 증폭이 이루어질 때까지 -20°C에 배치됩니다. DeNovix dsDNA 고감도 분석 키트(Illumina 2013)를 사용하여 DNA를 정량화합니다.

2- PCR 기반 KABA KAPA 라이브러리 정량 키트에는 Illumina 플랫폼에서 시퀀싱을 위해 준비된 NGS(차세대 시퀀싱) 라이브러리의 정확하고 안정적이며 재현 가능한 qPCR 기반 정량에 필요한 모든 시약이 포함되어 있습니다. 키트에는 KAPA SYBR FAST qPCR 마스터 믹스(다양한 qPCR 장비에 대해 다양한 수동 참조 염료로 구성), 플랫폼별 라이브러리 정량화 프라이머 프리믹스 및 사전 희석된 DNA 표준 세트가 포함되어 있습니다.

16S rRNA 유전자 V3-V4 영역은 Illumina 어댑터와 인덱싱 바코드를 통합하는 융합 프라이머로 증폭됩니다. PCR 단계에서는 클러스터 생성 및 시퀀싱에 필요한 인덱스 1(i7) 및 인덱스 2(i5), 시퀀싱, 공통 어댑터(P5 및 P7)를 추가합니다. NGS 라이브러리의 품질 관리 분석을 개선하기 위해 Bioanalyzer 시스템을 사용한 고감도 DNA 전기영동이 수행됩니다. 3- 16S rRNA 유전자 라이브러리 준비 및 MiSeq 시퀀싱. 16S rDNA의 PCR 증폭, 시퀀싱 및 분석은 박테리아 MiSeq 시약 키트 v3(600주기)의 V3V4 영역을 표적으로 하는 NGS Illumina MiSeq를 통해 수행됩니다. 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱(16S 분석)은 차세대 시퀀싱 기술로 미생물군을 분석하는 데 널리 사용됩니다. 표준 V3-V4 프라이머(V34) 세트의 16S 분석 데이터는 방광 미생물군 분석 프로토콜을 최적화합니다. 4- 생물정보학 및 통계 분석. 주석이 달린 게놈은 생물정보 파이프라인을 사용하여 추가로 분석되어 병원체의 생물학과 질병 유발 가능성에 대한 통찰력을 얻습니다. 여기에는 다음이 포함됩니다.

- 오류를 제거하고 공백을 메워 초안 게놈의 품질 관리 및 개선.

• 유전자의 기능 및 기타 특징을 식별하고 설명하는 것을 포함하여 최종 게놈에 대한 주석입니다.
• 차이점과 유사성을 식별하기 위해 새로 배열된 게놈을 관련 병원체의 게놈과 비교하는 것을 포함하는 비교 게놈학.
• 기능 분석: 여기에는 주석이 달린 유전자의 기능을 식별하고 이들이 참여하는 경로와 프로세스를 이해하는 것이 포함됩니다. 이는 주요 병독성 요인을 밝혀내고 병원체의 발병 메커니즘을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
• 계통발생학적 분석: 새로 배열된 게놈을 다른 개체의 게놈과 비교하는 작업이 포함됩니다.
• 진화적 관계를 결정하고 다양한 개체군에서 병원체의 확산을 추적하기 위해 관련 병원체를 분석합니다.
• 방광암과 건강한 사람의 전반적인 미생물 구성의 차이

• 샘플이 평가됩니다. NGS는 TBRI에서 사용할 수 없으며 16S 시퀀싱 및 생물정보학은 Children Hospital 57357에서 유료로 수행됩니다("유료" 원칙에 따라 시퀀싱을 수행하는 것을 환영합니다).

  16S 리보솜 RNA(rRNA) 서열 분석

  1. 소변과 조직에서 DNA를 분리합니다. 소변 검체(50ml)를 해동하고 7500g, 4°C에서 10분간 원심분리합니다. 펠렛은 마이크로바이옴 DNA 정제 키트를 사용하여 DNA 추출에 사용됩니다. 환경 오염을 방지하기 위해 소변 샘플과 시약 전용 추출 컨트롤의 모든 분리는 PCR 후드 내에서 수행됩니다. 분리된 DNA 샘플은 PCR 증폭이 이루어질 때까지 -20°C에 배치됩니다. DNA는 분석 키트(Illumina 2013)를 사용하여 정량화됩니다.
  2. PCR 기반 KABA KAPA 라이브러리 정량 키트에는 Illumina 플랫폼에서 시퀀싱을 위해 준비된 NGS(차세대 시퀀싱) 라이브러리의 정확하고 안정적이며 재현 가능한 qPCR 기반 정량화에 필요한 모든 시약이 포함되어 있습니다. 플랫폼별 라이브러리 정량화 프라이머 프리믹스 및 사전 희석된 DNA 표준 세트.

  16S rRNA 초가변 영역 V1V2 및 V3-V4 영역은 Illumina 어댑터와 인덱싱 바코드를 통합하는 융합 프라이머로 증폭됩니다.

NGS 라이브러리의 품질 관리 분석을 개선하기 위해 Bioanalyzer 시스템을 사용한 고감도 DNA 전기영동이 수행됩니다.

3- 16S rRNA 유전자 라이브러리 준비 및 MiSeq 시퀀싱. 16S rRNA의 PCR 증폭, 서열분석 및 분석은 V1-V2 및 V3-V4 영역을 표적으로 하는 NGS Illumina를 통해 수행됩니다. 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱(16S 분석)은 차세대 시퀀싱 기술로 미생물군을 분석하는 데 사용됩니다. 방광 미생물군 분석 프로토콜을 최적화하기 위한 표준 V1-V2, V3-V4 프라이머 세트의 16S 분석 데이터입니다.

4- 생물정보학 및 통계 분석. 주석이 달린 게놈은 생물정보 파이프라인을 사용하여 추가로 분석되어 병원체의 생물학과 질병 유발 가능성에 대한 통찰력을 얻습니다.

참고자료

1. Bučević Popović V, Šitum M, Chow CT, Chan LS, Roje B, Terzić J. 방광암과 관련된 비뇨기 미생물군집. Sci Rep. 2018 8월 14;8(1):12157. 도이: 10.1038/s41598-018-29054-w.
2. Wishahi, M., Otto, T. & Golka, K. Re: 신경성 방광 및 요로 주혈 흡충증 환자의 방광 암종-동일한 종양입니까? World J Urol 40, 2139-2140 (2022). https://doi.org/10.1007/s00345-022-04076-2
3. Hanan R, Murata M, Ma N, Hammam O, Wishahi M, El Leithy T, Hiraku Y, Oikawa S, Kawanishi S (2012) 방광암에서 줄기성 마커의 발현과 관련된 COX-2의 핵 위치. Mediat Inflamm 2012:165879 2012;2012:165879. 도이: 10.1155/2012/165879.
4. Cancrini F, Michel F, Cussenot O, Alshehhi H, Comperat E, Phé V (2022) 신경성 방광 및 요로 주혈흡충증 환자의 방광 암종: 동일한 종양입니까? 월드 J 우롤. https://doi.org/10.1007/s00345-022-03941-4
5. Hammam O, Wishahi M, Khalil H, El Ganzouri H, Badawy M, Elkhquly A, Elesaily K (2014) 이집트 요로 방광암의 요로 상피 암종 및 편평 세포 암종에서 시토케라틴 7, 20, 14의 발현. J Egypt Soc Parasitol 44(3):733-740
6. Zitvogel L, Daillère R, Roberti MP, Routy B, Kroemer G. 미생물 군집 및 그 제품의 항암 효과. Nat. 미생물 목사. 2017;15:109-128. doi: 10.1038/nrmicro.2017.44.
7. Whiteside SA, Razvi H, Dave S, 리드 G, 버튼 JP. 요로의 미생물군집 - 감염 이상의 역할. Nat. 우롤 목사. 2015;12:81-90. 도이: 10.1038/nrurol.2014.361.
8. Xu W, 외. 미니 검토: 요로상피암종의 발병기전에서 미생물군집의 관점. 오전. J. 클린. 특급. 우롤. 2014;2:57-61.
9. 브루베이커, L., 구르딘, J.-P. F., Siddiqui, N. Y., Holland, A., Halverson, T., Limeria, R., et al. (2021a). Urobiome 연구를 발전시키기 위한 합의 형성. mSystems 6, e0137120. doi: 10.1128/mSystems.01371-20
10. Brubaker, L., Putonti, C., Dong, Q. 및 Wolfe, A. J. (2021b). 인간 우로비옴. 맘. 게놈 32, 232-238. 도이: 10.1007/s00335-021-09862-8
11. -Carrasco, V., Soriano-Lerma, A., Soriano, M., J. 및 Garcia-Salcedo, J. A. (2021). 요로 미생물군집: 요로의 음과 양. 앞쪽. 셀. 감염. 미생물. 11. 도이: 10.3389/fcimb.2021.617002
12. 43. 우 N, 외. 대장암 환자의 대변 미생물총의 불균형 징후. 미생물. Ecol. 2013;66:462-470. 도이: 10.1007/s00248-013-0245-9.