肝疾患における微生物と宿主反応の評価 (MILD)

目的とデザイン:

この調査研究の重要な課題は、肝疾患の発症と進行における腸内微生物叢（細菌、真菌、ウイルス）の役割を解明することです。 肝疾患において腸内微生物の性質に変化があることを示唆する既存の文献が多数存在する。 しかし、肝疾患における「腸管バイローム」の具体的な役割は、まだ新興分野です。 肝疾患では、管腔内の細菌や真菌との関係、および宿主免疫系との相互作用を特徴づける必要があります。 この研究は、肝疾患における宿主と微生物の動態を調べることを目的としており、これはこれらの疾患の病因のより深い理解につながるだけでなく、進行を防ぐための治療介入の設計にも役立ちます。 この提案はアバディーン王立診療所の同僚による査読を受けています。 結果は、科学雑誌への出版や公共参加フォーラムを通じて広く普及される予定です。

募集：

患者は、ピーター・ブラント胃腸（GI）および肝臓クリニック、およびアバディーン王立診療所の消化器および肝臓病棟から募集されます。 外来参加者には、情報を理解するのに十分な時間を確保できるよう、臨床参加前にクリニック予約通知書とともに参加者情報シートが郵送で送信されます。 クリニックの予約時に臨床チームのメンバーから同意を得て、糞便サンプルの採取キットが渡されます。 病棟で治療を受けている肝臓疾患の患者様に対しては、インフォームドコンセントを得た上で糞便の採取を行っております。 肝疾患の原因と病期に関する情報は、これらの患者の症例記録から定期的に収集されます。 また、腸内細菌叢の経時的進化を観察するために、より長期間にわたって患者のサブグループから糞便サンプルを入手したいと考えています。 6 か月間にさらに 2 回の糞便サンプルを要求します。 これらのサンプルをアバディーン大学医科学研究所の研究室に配送するために必要なすべての収集容器と情報が提供されます。 最後に、負荷試験のために患者のサブセット (n=25) から血液サンプルを要求する場合があります。 このサブグループの患者から合計 30 ml の血液が採取されます。 これらの患者は臨床チームによって特別に同意されます。

肝生検のリストに登録されると、非常に少数の患者グループが特定されます。 この手順は、診断上の理由から、または肝疾患患者の特定のコホートにおいて疾患を段階的に進行させるために行われます。 生検を行うかどうかの決定は、コンサルタントの肝臓専門医によって行われます。 生検は 1 日単位で計画的に行われます。 患者には、処置のために来院するための予約通知書が送られます。 事前に情報を検討するために、参加情報シートもこれらの手紙と一緒に送信されます。 生検当日に臨床チームのメンバーの同意を得ます。

肝生検はコンサルタントの放射線科医によって行われます。 診断目的に必要な肝組織を超える部分が主要サンプルから切り取られます。 この部分は 0.5 cm を超えず、少なくとも 2 cm の肝臓組織が臨床的および病理学的評価のために研究室に送られます。 研究のために採取された部分は保管され、作業パッケージ 3 の評価のために液体窒素フラスコに入れてアバディーン大学の研究室に輸送されます。 次に、単一細胞 RNA シーケンス分析 (ScRNAseq) 分析のためにこれらのサンプルから細胞が単離されます。 肝組織は、代謝変化の正確な領域の位置を特定する空間トランスクリプトミクスを実行するためにも利用されます。 これらの細胞は、組織オルガノイドの作成にも使用されます。

肝臓研究看護師 2 名と肝臓病研究員 1 名が研究の調整を支援します。 5 人のコンサルタントの肝臓専門医と専門登録者がおり、将来の患者の特定を支援します。 我々は、より広範な研究のために提案された5年間の研究期間にわたって、200の肝疾患患者サンプルセットと、対応する数の適切に適合した対照被験者の収集を期待している。 同じ期間に肝生検サブグループ研究には 50 人の被験者が参加すると予想されます。

対照被験者は、アバディーン大学およびアバディーン王立診療所から募集された健康なボランティアとなります。 この研究はパンフレットを通じて宣伝されます。 対照参加者には研究チームから連絡があり、同意が得られる 24 時間前に参加情報シートが電子メールで送信されるか、直接手渡されます。 これにより、調査研究を読んで理解する時間が確保されます。 最初の選考会議が開催され、ボランティアは研究チームのメンバーと面会します。 研究の対象/除外基準を満たしていることを確認するために、年齢、体重、関連する健康状態や定期的に服用している薬の詳細を詳述する基本的な健康質問票に記入するよう求められます。 参加基準を満たしている場合、同意書への署名を求められ、その後正式に研究に参加させられます。 彼らには、自分の身元を匿名に保つために常に使用される研究番号が与えられます。

被験者の記録は、研究で採用されたすべての患者と対照について維持され、アバディーン大学の施錠されたキャビネットに安全に保管されます。

方法論

この研究はアバディーン大学、医科学研究所、ロウェット研究所の研究所で実施される。 この研究は、以下に説明する 3 つの作業パッケージを通じて、肝疾患における腸内細菌叢と宿主免疫応答の役割を解明することを目的としています。

作業パッケージ 1: 肝疾患における腸内細菌叢の変化の調査

この作業パッケージには、以下の評価のための適格な患者および健康な対照からの糞便サンプルの収集が含まれます。

A) 肝疾患患者の腸内細菌叢の変化を調査するには: 分子分析には、患者から収集した糞便サンプルから DNA および RNA を抽出する必要があります。 PCR ベースの評価は、微生物の多様性を研究するために普遍的なアプローチとグループ/種に向けたアプローチの両方を使用して採用されます。 PCR 分析に続いて、クローン ライブラリー構築およびサンガー シーケンシング、さらにはプローブ ベースのアプローチを含む (ただしこれらに限定されない) 他の分析方法を使用することもできます。 16sRNA 遺伝子配列決定、メタゲノミクス、メタトランスクリプトミクス、メタボロミクス、メタプロテオミクスなどのオミクスベースのアプローチも、微生物の多様性と機能の研究に使用されます。

B) 肝疾患に関連する特定の微生物の病原性の可能性を単離および特徴づける: 糞便サンプルの微生物学的評価により、従来の微生物培養技術を使用してサンプルから特定の微生物 (細菌、ウイルス、真菌) を数えることができます。 これらの分離株はその後同定され、病原性の可能性が評価されます。 これには、特定の形質を特徴付ける全ゲノム配列決定などの技術を利用した病原性のゲノム評価が含まれます。 また、胆汁酸塩、アルコール、短鎖脂肪酸の代謝に関連する経路の変化を調べるために、病原性微生物のメタボローム評価も行います。 これには、病原菌株のトランスクリプトーム評価と、その代謝の副産物を研究するためのガスクロマトグラフィーが含まれます。

作業パッケージ 2: 肝疾患における特定の微生物に対する宿主反応の評価 この作業パッケージには、患者および対照からの 30 ml の血液の採取が含まれます。 この被験者グループは、特に血液検査について同意されます。 この血液は、チャレンジ研究に必要なマクロファージを生成するために使用されます。 研究 1 で特定された病原微生物は、細胞株、組織オルガノイド、および実験動物モデルに対する負荷実験を通じて、炎症誘発性の可能性について評価されます。 募集時に採取された血液は、研究 1 で特定された感染性病原体による攻撃後の炎症性メディエーターの証拠について評価されます。収集された全血 ~ 30 ml (大さじ 2 杯) には、細菌/ウイルスおよび真菌細胞のパネルが追加され、これらは最長 48 時間インキュベートできます。 炎症発生の証拠は、ELISA およびフローサイトメトリー分析 (ただしこれらに限定されない) を含む分子技術を使用して研究されます。 一部の被験者では、これらの推定上の病原体に対する全身免疫反応を評価するために、血液を採取して末梢血単球細胞 (PBMC) を抽出します。

作業パッケージ 3: 患者からの肝臓生検を分析することにより、肝臓の免疫微小環境の変化を特徴付けます。 この作業パッケージは、腸内病原体に反応して肝臓内で起こっている炎症性変化を解明するために行われます。 臨床上の理由で肝生検を受ける患者の小サブグループには、診断目的に必要な量を超える肝臓組織の一部を採取することに同意することになります。 大部分は病理学的評価のために送られます。 このわずかな余分な部分は放射線科医によって肝生検から切り取られ、直ちに研究チームのメンバーに引き渡されます。 これは液体窒素フラスコに入れてアバディーン大学の研究室に運ばれ、処理されます。 次に、肝細胞は、単細胞 RNA 配列分析 (ScRNAseq) のためにこれらの肝生検サンプルから単離されます。 肝組織は、代謝変化の正確な領域の位置を特定する空間トランスクリプトミクスを実行するためにも利用されます。