Mikro-organismien ja isännän vasteen arviointi maksasairauksissa (MILD)

Tarkoitus ja suunnittelu:

Tämän tutkimuksen keskeinen kysymys on selvittää suoliston mikrobiotan (bakteerit, sienet ja virukset) roolia maksasairauden kehittymisessä ja etenemisessä. On olemassa suuri määrä kirjallisuutta, joka viittaa siihen, että suolistomikrobien luonne on muuttunut maksasairauksissa. "Suolistoviromin" erityinen rooli maksasairaudessa on kuitenkin edelleen nouseva ala. Sen suhde ontelossa oleviin bakteereihin ja sieniin sekä vuorovaikutus isännän immuunijärjestelmän kanssa on karakterisoitava maksasairauksissa. Tämän tutkimuksen tavoitteena on tarkastella isäntä-mikrobidynamiikkaa maksasairaudissa, mikä ei johda pelkästään näiden sairauksien patogeneesin parempaan ymmärtämiseen, vaan myös auttaa suunnittelemaan terapeuttisia interventioita etenemisen estämiseksi. Aberdeen Royal Infirmaryn kollegat ovat vertaisarvioineet ehdotuksen. Tulosten laajempi levittäminen toteutetaan julkaisujen kautta tieteellisissä aikakauslehdissä ja julkisten osallistumisfoorumien kautta.

Rekrytointi:

Potilaat rekrytoidaan Peter Brunt Gastrointestinal (GI) ja Liver -klinikalta sekä Aberdeen Royal Infirmaryn GI- ja maksaosastolta. Avohoidossa oleville potilaille lähetetään osallistujatietolomakkeet postitse ennen kliinistä vastaanottoa klinikan ajanvarauskirjeen kanssa, jotta heillä on riittävästi aikaa ymmärtää tiedot. Heidän vastaanotollaan kliinisen tiimin jäsen antaa heille suostumuksensa, ja heille luovutetaan keräyspakkaus ulostenäytettä varten. Osastolla hoitoa saavilta maksasairautta sairastavilta otamme ulostenäytteet tietoisen suostumuksen saatuaan. Tietoja maksasairauden syystä ja vaiheesta kerätään rutiininomaisesti näiden potilaiden tapauskirjoista. Haluaisimme myös saada ulostenäytteitä potilasalaryhmältä pidemmällä aikavälillä nähdäksemme suoliston mikrobiotan kehityksen ajan myötä. Pyydämme vielä kaksi ulostenäytettä kuuden kuukauden aikana. Kaikki tarvittavat keräysastiat ja tiedot näiden näytteiden toimittamiseksi Aberdeenin yliopiston lääketieteen instituutin tutkimuslaboratorioon toimitetaan. Lopuksi voimme pyytää verinäytettä potilaiden osajoukolta (n = 25) altistustutkimuksia varten. Tästä potilasryhmästä kerätään yhteensä 30 ml verta. Nämä potilaat saavat nimenomaisen suostumuksen kliiniseltä ryhmältä.

Hyvin pieni ryhmä potilaita tunnistetaan, kun heidät merkitään maksabiopsiaan. Tämä toimenpide tehdään diagnostisista syistä tai taudin vaiheistamiseksi tietyssä maksasairautta sairastavien potilaiden ryhmässä. Päätöksen biopsian tekemisestä tekee heidän konsultti hepatologinsa. Biopsia tehdään päivähoitoyksikössä suunnitelmallisesti. Potilaille lähetetään ajanvarauskirje toimenpiteeseen saapumisesta. Osallistumistietolomakkeet lähetetään näiden kirjeiden mukana, jotta tiedot voidaan harkita etukäteen. Kliinisen tiimin jäsen antaa heille suostumuksen biopsiapäivänä.

Maksan biopsian suorittaa konsulttiradiologi. Päänäytteestä leikataan pois osa maksakudosta, joka ylittää diagnostisiin tarkoituksiin tarvittavan määrän. Osuus ei saa olla suurempi kuin 0,5 cm, ja vähintään 2 cm maksakudosta lähetetään laboratorioon kliinistä ja patologista arviointia varten. Tutkimukseen otettu annos säilytetään ja kuljetetaan Aberdeenin yliopiston laboratorioon nestetyppipullossa työpaketin 3 arviointia varten. Solut eristetään sitten näistä näytteistä yksisoluisen RNA-sekvensointianalyysin (ScRNAseq) analyysiä varten. Maksakudosta käytetään myös spatiaalisen transkriptomiikan suorittamiseen, joka paikallistaa metabolisen muutoksen tarkan alueen. Näitä soluja käytetään myös kudosorganoidien luomiseen.

Paikalla on kaksi maksatutkimushoitajaa ja hepatologian tutkija, jotka auttavat tutkimuksen koordinoinnissa. Paikalla on viisi hepatologia ja erikoisrekisteröijää, jotka auttavat mahdollisten potilaiden tunnistamisessa. Odotamme 200 maksasairauspotilasnäytesarjan ja vastaavan määrän sopivasti yhteensopivia kontrollihenkilöitä keräävän kokoelman viiden vuoden ehdotetun tutkimusjakson aikana laajempaa tutkimusta varten. Odotamme maksan biopsian alaryhmätutkimukseen 50 henkilöä samalla ajanjaksolla.

Kontrollihenkilöt ovat terveitä vapaaehtoisia, jotka on värvätty Aberdeenin yliopistosta ja Aberdeen Royal Infirmarysta. Tutkimuksesta tiedotetaan pamflettien avulla. Tutkimusryhmä ottaa kontrollin osallistujiin yhteyttä ja heille lähetetään osallistumistietolomakkeet, jotka lähetetään sähköpostitse tai luovutetaan henkilökohtaisesti 24 tuntia ennen suostumuksen saamista. Tämä varmistaa, että heillä on aikaa lukea ja ymmärtää tutkimustutkimus. Alkuseulontakokous pidetään, jonka aikana vapaaehtoinen tapaa tutkimusryhmän jäsenen. Heitä pyydetään täyttämään perusterveyskysely, jossa kerrotaan iästä, painosta ja kaikista asiaan liittyvistä terveydellisistä tiloista ja säännöllisistä lääkityksistä sen varmistamiseksi, että he täyttävät tutkimuksen mukaanotto-/poissulkemiskriteerit. Jos he täyttävät osallistumiskriteerit, heitä pyydetään allekirjoittamaan suostumuslomake ja heidät värvätään sitten virallisesti tutkimukseen. Heille annetaan tutkimusnumero, jota käytetään aina heidän henkilöllisyytensä anonyyminä pitämiseen.

Kaikista tutkimukseen rekrytoiduista potilaista ja kontrolleista pidetään aihelokia, jota säilytetään turvallisesti lukitussa kaapissa Aberdeenin yliopistossa.

Metodologia

Tutkimus suoritetaan Aberdeenin yliopiston, Institute of Medical Sciences ja Rowett Instituten tutkimuslaboratorioissa. Tutkimuksen tavoitteena on selvittää suoliston mikrobiotan ja isännän immuunivasteen rooli maksasairaudessa kolmen alla kuvatun työpaketin avulla:

Työpaketti 1: Suoliston mikrobiotan muutoksen tutkimus maksasairaudissa

Tämä työpaketti sisältää ulostenäytteiden keräämisen kelvollisilta potilailta ja terveiltä kontrolleilta seuraavia arviointeja varten:

A) Suoliston mikrobiotan muutoksen tutkiminen maksasairautta sairastavilla potilailla: Molekyylianalyysit edellyttävät DNA:n ja RNA:n uuttamista potilailta kerätyistä ulostenäytteistä. PCR-pohjaista arviointia käytetään sekä yleismaailmallisella että myös ryhmä-/lajisuuntautuneella lähestymistavalla mikrobien monimuotoisuuden tutkimuksessa. PCR-analyysin jälkeen voidaan käyttää muita analyyttisiä menetelmiä, mukaan lukien (mutta ei yksinomaan) kloonikirjaston rakentaminen ja Sanger-sekvensointi sekä myös koetuksiin perustuvat lähestymistavat. Mikrobien monimuotoisuuden ja toiminnan tutkimiseen käytetään myös omiikkaan perustuvia lähestymistapoja, kuten 16sRNA-geenin sekvensointia, metagenomiikkaa, metatranskriptomiikkaa, metabolomiikkaa ja metaproteomiikkaa.

B) Eristä ja karakterisoi tiettyjen maksasairauksiin liittyvien mikrobien patogeeninen potentiaali: Ulostenäytteiden mikrobiologinen arviointi antaa meille mahdollisuuden luetella näytteistä tietyt mikrobit (bakteerit, virukset ja sienet) käyttämällä tavanomaisia ​​mikrobiologisia viljelytekniikoita. Sitten nämä isolaatit tunnistetaan ja niiden patogeneettinen potentiaali arvioidaan. Tämä sisältää patogeenisyyden genomisen arvioinnin käyttämällä tekniikoita, kuten koko genomin sekvensointia, tiettyjen ominaisuuksien karakterisoimiseksi. Suoritamme myös patogeenisten mikrobien metabolomisen arvioinnin etsiäksemme muutoksia sappisuolan, alkoholin ja lyhytketjuisten rasvahappojen aineenvaihduntaan liittyvissä reiteissä. Tämä edellyttää patogeenisten kantojen transkriptomista arviointia sekä kaasukromatografiaa niiden aineenvaihdunnan sivutuotteiden tutkimiseksi.

Työpaketti 2: Isännän vasteen arviointi tietyille mikrobeille maksasairauksissa Tämä työpaketti sisältää 30 ml:n verta keräämisen potilailta ja kontrolleilta. Tämä ryhmä hyväksytään erityisesti verikokeita varten. Tätä verta käytetään makrofagien tuottamiseen, joita tarvitaan altistustutkimuksissa. Tutkimuksessa 1 tunnistettujen patogeenisten mikrobien pro-inflammatorinen potentiaali arvioidaan altistuskokeiden avulla solulinjoilla, kudosorganoideilla ja kokeellisilla eläinmalleilla. Rekrytointihetkellä otetusta verestä arvioidaan todisteita tulehduksen välittäjistä sen jälkeen, kun se on altistettu tutkimuksessa 1 tunnistetuille tartunta-aineille. Kokoverta, joka on kerätty ~ 30 ml:aan (2 ruokalusikallista), lisätään bakteeri-/virus- ja sienisolujen paneeli, ja nämä inkuboidaan jopa 48 tuntia. Todisteita tulehduksen kehittymisestä tutkitaan käyttämällä molekyylitekniikoita, mukaan lukien (mutta ei yksinomaan) ELISA ja virtaussytometrinen analyysi. Osalta koehenkilöistä otetaan verta perifeerisen veren monosyyttisolujen (PBMC) erottamiseksi systeemisen immuunivasteen arvioimiseksi näitä oletettuja patogeenejä vastaan.

Työpaketti 3: karakterisoi maksan immuuni-mikroympäristön muutoksia analysoimalla potilaiden maksabiopsiat. Tämä työpaketti tehdään maksassa tapahtuvien tulehduksellisten muutosten selvittämiseksi vasteena suoliston taudinaiheuttajille. Pienelle alaryhmälle potilaita, joille tehdään maksabiopsia kliinisistä syistä, hyväksytään pieni osa maksakudosta, joka ylittää sen, mitä tarvitaan diagnostisiin tarkoituksiin. Isompi osa lähetetään patologiseen arviointiin. Radiologi leikkaa tämän pienen ylimääräisen osan maksabiopsiasta ja luovuttaa sen välittömästi tutkimusryhmän jäsenelle. Tämä kuljetetaan nestetyppipullossa Aberdeenin yliopiston laboratorioon käsittelyä varten. Hepatosyytit eristetään sitten näistä maksabiopsianäytteistä yksisoluisen RNA-sekvensointianalyysin (ScRNAseq) avulla. Maksakudosta käytetään myös spatiaalisen transkriptomiikan suorittamiseen, joka paikallistaa metabolisen muutoksen tarkan alueen.