Vurdering av mikroorganismer og vertsrespons ved leversykdommer (MILD)

Formål og design:

Nøkkelspørsmålet i denne forskningsstudien er å belyse rollen til tarmmikrobiota (bakterier, sopp og virus) i utviklingen og progresjonen av leversykdom. Det er en stor mengde eksisterende litteratur som tyder på at det er en endring i tarmmikrobens natur ved leversykdommer. Imidlertid er den spesifikke rollen til "tarmviromet" i leversykdom fortsatt et felt i vekst. Dens forhold til bakterier og sopp i lumen og interaksjon med vertens immunsystem må karakteriseres ved leversykdommer. Denne studien tar sikte på å se på verts-mikrobedynamikken i leversykdommer, som ikke bare vil føre til en bedre forståelse av patogenesen til disse sykdommene, men også hjelpe til med å designe terapeutiske intervensjoner for å forhindre progresjon. Forslaget har blitt fagfellevurdert av kolleger ved Aberdeen Royal Infirmary. Bredere spredning av resultatene vil skje gjennom publikasjoner i vitenskapelige tidsskrifter og gjennom offentlige engasjementsfora.

Rekruttering:

Pasienter vil bli rekruttert fra Peter Brunt Gastrointestinal (GI) og leverklinikk, og GI og leveravdelingen ved Aberdeen Royal Infirmary. Polikliniske deltakere vil få tilsendt deltakerinformasjonsark per post før deres kliniske oppmøte sammen med klinikkavtalebrevet, slik at de har nok tid til å forstå informasjonen. Ved deres klinikkavtale vil de få samtykke fra et medlem av det kliniske teamet, og et oppsamlingssett overleveres til dem for en avføringsprøve. For pasienter med leversykdom som får behandling på avdelingen vil vi ta avføringsprøver etter at informert samtykke er innhentet. Informasjon om årsak og stadium av leversykdom vil rutinemessig bli samlet inn fra saksjournalene til disse pasientene. Vi ønsker også å få avføringsprøver fra en undergruppe av pasienter over et lengre tidsforløp for å se utviklingen av tarmmikrobiota over tid. Vi vil be om ytterligere to avføringsprøver over en periode på seks måneder. Alle nødvendige samlebeholdere og informasjon for levering av disse prøvene til forskningslaboratoriet ved Institute of Medical Sciences, University of Aberdeen vil bli gitt. Til slutt kan vi be om en blodprøve fra en undergruppe av pasienter (n=25) for utfordringsstudier. Det vil samles inn totalt 30 ml blod fra denne undergruppen av pasienter. Disse pasientene vil bli gitt spesifikt samtykke fra det kliniske teamet.

En svært liten gruppe pasienter vil bli identifisert når de er oppført for en leverbiopsi. Denne prosedyren gjøres av diagnostiske årsaker eller for å iscenesette sykdommen i en bestemt gruppe pasienter med leversykdom. Beslutningen om å ta biopsien tas av deres konsulterende hepatolog. Biopsien gjøres i en dagsaksenhet på en planlagt måte. Pasientene får tilsendt et avtalebrev for å komme inn til prosedyren. Informasjonsarkene for deltakelse vil bli sendt sammen med disse brevene, for å vurdere informasjonen på forhånd. De vil godkjennes av et medlem av det kliniske teamet på dagen for biopsien.

Leverbiopsien utføres av en rådgivende radiolog. En del av levervevet utover det som kreves for diagnostiske formål vil bli avskåret fra hovedprøven. Porsjonen vil ikke være mer enn 0,5 cm med minst 2 cm levervev sendt til laboratoriene for klinisk og patologisk vurdering. Den delen som tas til forskning vil bli oppbevart og transportert til University of Aberdeen lab i en flytende nitrogenkolbe for vurdering av arbeidspakke 3. Celler vil deretter bli isolert fra disse prøvene for encellet RNA-sekvensanalyse (ScRNAseq) analyse. Levervev vil også bli brukt til å utføre romlig transkriptomikk som vil lokalisere det nøyaktige området for metabolsk endring. Disse cellene vil også bli brukt til å lage vevsorganoider.

Det er to leverforskningssykepleiere og en hepatologistipendiat som vil hjelpe til med å koordinere studiet. Det er fem rådgivende hepatologer og spesialistregistratorer som vil hjelpe til med å identifisere potensielle pasienter. Vi vil forutse innsamling av 200 leversykdomspasienter og et tilsvarende antall passende kontrollpersoner i løpet av den femårige foreslåtte studieperioden for den bredere studien. Vi forventer 50 forsøkspersoner for leverbiopsi-undergruppestudien i samme tidsperiode.

Kontrollpersoner vil være friske frivillige rekruttert fra University of Aberdeen og Aberdeen Royal Infirmary. Studien vil bli annonsert gjennom brosjyrer. Kontrolldeltakerne vil bli kontaktet av forskerteamet og vil få utdelt deltakelsesinformasjonsarkene som sendes på e-post eller overleveres personlig, 24 timer før samtykke innhentes. Dette vil sikre at de har tid til å lese og forstå forskningsstudien. Et første screeningsmøte vil finne sted hvor den frivillige vil møte et medlem av forskerteamet. De vil bli bedt om å fylle ut et grunnleggende helsespørreskjema som beskriver alder, vekt og detaljer om eventuelle relevante helsetilstander og vanlig medisinering for å sikre at de oppfyller inklusjons-/eksklusjonskriteriene for studien. Hvis de oppfyller inklusjonskriteriene, vil de bli bedt om å signere et samtykkeskjema og vil deretter bli formelt rekruttert til studien. De vil få et studienummer som til enhver tid vil bli brukt for å holde identiteten deres anonym.

En emnelogg vil bli opprettholdt for alle pasientene og kontrollene som er rekruttert i studien, som vil oppbevares trygt i et låst skap ved University of Aberdeen.

Metodikk

Studien vil bli utført i University of Aberdeen, Institute of Medical Sciences og Rowett Institute forskningslaboratorier. Studien tar sikte på å belyse rollen til tarmmikrobiota og vertsimmunrespons i leversykdom gjennom tre arbeidspakker som beskrevet nedenfor:

Arbeidspakke 1: Undersøkelse av endring av tarmmikrobiota ved leversykdommer

Denne arbeidspakken innebærer innsamling av avføringsprøver fra kvalifiserte pasienter og friske kontroller for følgende vurderinger:

A) For å undersøke endringen av tarmmikrobiotaen hos pasienter med leversykdommer: Molekylære analyser vil kreve DNA- og RNA-ekstraksjon fra avføringsprøver samlet fra pasienter. PCR-basert vurdering vil bli brukt ved bruk av både universelle og også gruppe-/artsrettede tilnærminger for å studere mikrobiell mangfold. Etter PCR-analyse kan andre analytiske metoder brukes, inkludert (men ikke utelukkende) klonbibliotekkonstruksjon og Sanger-sekvensering og også sonderingsbaserte tilnærminger. Omics-baserte tilnærminger som 16sRNA-gensekvensering, metagenomikk, metatranskriptomikk, metabolomikk og metaproteomikk vil også bli brukt for å studere mikrobiell mangfold og funksjon.

B) Isoler og karakteriser det patogene potensialet til spesifikke mikrober som er assosiert med leversykdommer: Mikrobiologisk vurdering av avføringsprøver vil tillate oss å telle opp spesifikke mikrober (bakterier, virus og sopp) fra prøver ved bruk av konvensjonelle mikrobiologiske kulturteknikker. Disse isolatene vil deretter bli identifisert og vurdert for deres patogenetiske potensial. Dette vil involvere genomisk vurdering av patogenisitet ved å bruke teknikker som helgenomsekvensering for å karakterisere spesifikke egenskaper. Vi vil også utføre metabolomisk vurdering av patogene mikrober for å se etter endringer i veier knyttet til gallesalt, alkohol og kortkjedet fettsyremetabolisme. Dette vil involvere transkriptomisk vurdering av de patogene stammene samt gasskromatografi for å studere biproduktene av deres metabolisme.

Arbeidspakke 2: Vurdering av vertsrespons på spesifikke mikrober ved leversykdommer Denne arbeidspakken vil innebære innsamling av 30 ml blod fra pasienter og kontroller. Denne gruppen av forsøkspersoner vil gis spesifikt samtykke til blodprøvetaking. Dette blodet vil bli brukt til å generere makrofager som vil være nødvendig for utfordringsstudiene. Patogene mikrober identifisert i studie 1 vil bli vurdert for deres pro-inflammatoriske potensial gjennom utfordringsforsøk på cellelinjer, vevsorganoider og eksperimentelle dyremodeller. Blod tatt på rekrutteringstidspunktet vil bli vurdert for tegn på inflammatoriske mediatorer etter utfordring med smittestoffer identifisert i studie 1. Fullblod samlet inn ~ 30 ml (2 spiseskjeer) vil ha et panel av bakterielle/virale og soppceller tilsatt og disse vil inkuberes i opptil 48 timer. Bevis på inflammatorisk utvikling vil bli studert ved bruk av molekylære teknikker inkludert (men ikke utelukkende) ELISA og flowcytometrisk analyse. I en del av forsøkspersonene vil det bli tatt blod for å trekke ut perifere blodmonocyttceller (PBMC) for å vurdere den systemiske immunresponsen mot disse antatte patogenene.

Arbeidspakke 3: Karakteriser endringene i leverens immunmikromiljø ved å analysere leverbiopsier fra pasienter. Denne arbeidspakken vil bli gjort for å belyse de inflammatoriske endringene som skjer i leveren som respons på tarmpatogenene. En liten undergruppe av pasienter som gjennomgår leverbiopsi av kliniske årsaker vil få samtykke for en liten del av levervevet utover det som kreves for diagnostiske formål. Den større delen vil bli sendt til patologisk vurdering. Denne lille overflødige delen vil bli avskåret fra leverbiopsien av radiologen og overlevert umiddelbart til et medlem av forskerteamet. Dette vil bli transportert i en flytende nitrogenkolbe til University of Aberdeen lab for prosessering. Hepatocytter vil deretter bli isolert fra disse leverbiopsiprøvene for encellet RNA-sekvensanalyse (ScRNAseq). Levervev vil også bli brukt til å utføre romlig transkriptomikk som vil lokalisere det nøyaktige området for metabolsk endring.