Évaluation des micro-organismes et de la réponse de l'hôte dans les maladies du foie (MILD)

Objectif et conception :

La question clé de cette étude est d’élucider le rôle du microbiote intestinal (bactéries, champignons et virus) dans le développement et la progression des maladies du foie. Il existe une grande quantité de littérature suggérant qu’il existe un changement dans la nature des microbes intestinaux dans les maladies du foie. Cependant, le rôle spécifique du « virome intestinal » dans les maladies du foie reste un domaine émergent. Sa relation avec les bactéries et les champignons présents dans la lumière et son interaction avec le système immunitaire de l'hôte doivent être caractérisées dans les maladies du foie. Cette étude vise à examiner la dynamique hôte-microbe dans les maladies du foie, ce qui permettra non seulement de mieux comprendre la pathogenèse de ces maladies, mais également d'aider à concevoir des interventions thérapeutiques pour prévenir leur progression. La proposition a été examinée par des collègues de l’Aberdeen Royal Infirmary. Une diffusion plus large des résultats se fera par le biais de publications dans des revues scientifiques et de forums de participation du public.

Recrutement:

Les patients seront recrutés dans la clinique gastro-intestinale (GI) et hépatique Peter Brunt, ainsi que dans le service gastro-intestinal et hépatique de l'Aberdeen Royal Infirmary. Les participants ambulatoires recevront des fiches d'information sur les participants par courrier avant leur présence clinique ainsi que leur lettre de rendez-vous à la clinique, pour qu'ils aient suffisamment de temps pour comprendre les informations. Lors de leur rendez-vous à la clinique, ils recevront l'accord d'un membre de l'équipe clinique et un kit de prélèvement leur sera remis pour un échantillon fécal. Pour les patients atteints d'une maladie du foie recevant un traitement dans le service, nous collecterons des échantillons fécaux après obtention du consentement éclairé. Les informations concernant la cause et le stade de la maladie hépatique seront régulièrement collectées à partir des dossiers de ces patients. Nous aimerions également obtenir des échantillons fécaux d’un sous-groupe de patients sur une période plus longue pour voir l’évolution du microbiote intestinal au fil du temps. Nous demanderons deux autres échantillons de matières fécales sur une période de six mois. Tous les conteneurs de collecte et informations nécessaires à la livraison de ces échantillons au laboratoire de recherche de l'Institut des sciences médicales de l'Université d'Aberdeen seront fournis. Enfin, nous pouvons demander un échantillon de sang à un sous-ensemble de patients (n = 25) pour des études de provocation. Un total de 30 ml de sang seront prélevés sur ce sous-groupe de patients. Ces patients recevront le consentement spécifique de l'équipe clinique.

Un très petit groupe de patients sera identifié lorsqu’ils seront inscrits pour une biopsie hépatique. Cette procédure est effectuée à des fins de diagnostic ou pour classer la maladie dans une cohorte spécifique de patients atteints d'une maladie du foie. La décision de faire la biopsie est prise par leur hépatologue consultant. La biopsie est réalisée en ambulatoire de manière planifiée. Les patients reçoivent une lettre de rendez-vous pour venir subir l’intervention. Les fiches de participation seront envoyées avec ces courriers, pour prendre en compte les informations au préalable. Ils seront consentis par un membre de l'équipe clinique le jour de la biopsie.

La biopsie hépatique est réalisée par un radiologue consultant. Une partie du tissu hépatique dépassant celle requise à des fins de diagnostic sera coupée de l'échantillon principal. La portion ne dépassera pas 0,5 cm avec au moins 2 cm de tissu hépatique envoyé aux laboratoires pour évaluation clinique et pathologique. La partie prélevée pour la recherche sera conservée et transportée au laboratoire de l'Université d'Aberdeen dans un flacon d'azote liquide pour l'évaluation du module de travail 3. Les cellules seront ensuite isolées de ces échantillons pour une analyse par séquençage d'ARN unicellulaire (ScRNAseq). Le tissu hépatique sera également utilisé pour effectuer une transcriptomique spatiale qui localisera la zone exacte d'altération métabolique. Ces cellules seront également utilisées pour créer des organoïdes tissulaires.

Il y a deux infirmières en recherche sur le foie et un chercheur en hépatologie qui aideront à coordonner l'étude. Cinq hépatologues consultants et registraires spécialisés aideront à identifier les patients potentiels. Nous prévoyons la collecte de 200 ensembles d'échantillons de patients atteints d'une maladie du foie et d'un nombre correspondant de sujets témoins correctement appariés au cours de la période d'étude proposée de cinq ans pour l'étude plus large. Nous prévoyons 50 sujets pour l'étude du sous-groupe de biopsie hépatique au cours de la même période.

Les sujets témoins seront des volontaires sains recrutés à l'Université d'Aberdeen et à l'Aberdeen Royal Infirmary. L'étude sera annoncée au moyen de brochures. Les participants témoins seront contactés par l'équipe de recherche et recevront les fiches d'information de participation qui seront envoyées par email ou remises en personne, 24 heures avant l'obtention du consentement. Cela garantira qu’ils auront le temps de lire et de comprendre l’étude de recherche. Une première réunion de sélection aura lieu au cours de laquelle le volontaire rencontrera un membre de l'équipe de recherche. Il leur sera demandé de remplir un questionnaire de santé de base détaillant l'âge, le poids et les détails de tout problème de santé pertinent et des médicaments réguliers pour s'assurer qu'ils répondent aux critères d'inclusion/exclusion de l'étude. S'ils répondent aux critères d'inclusion, il leur sera alors demandé de signer un formulaire de consentement et seront ensuite officiellement recrutés dans l'étude. Ils recevront un numéro d'étude qui sera utilisé à tout moment pour garder leur identité anonyme.

Un journal des sujets sera tenu pour tous les patients et contrôles recrutés dans l'étude qui sera conservé en toute sécurité dans une armoire verrouillée de l'Université d'Aberdeen.

Méthodologie

L'étude sera réalisée dans les laboratoires de recherche de l'Université d'Aberdeen, de l'Institut des sciences médicales et du Rowett Institute. L'étude vise à élucider le rôle du microbiote intestinal et de la réponse immunitaire de l'hôte dans les maladies du foie à travers trois lots de travaux décrits ci-dessous :

Work package 1 : Enquête sur l'altération du microbiote intestinal dans les maladies du foie

Ce module de travail implique la collecte d'échantillons fécaux auprès de patients éligibles et de témoins sains pour les évaluations suivantes :

A) Pour étudier l'altération du microbiote intestinal chez les patients atteints de maladies du foie : Les analyses moléculaires nécessiteront l'extraction d'ADN et d'ARN à partir d'échantillons fécaux prélevés sur des patients. L'évaluation basée sur la PCR sera utilisée en utilisant à la fois des approches universelles et également dirigées par des groupes/espèces pour étudier la diversité microbienne. Après l'analyse PCR, d'autres méthodes analytiques peuvent être utilisées, notamment (mais pas exclusivement) la construction d'une bibliothèque de clones et le séquençage Sanger, ainsi que des approches basées sur le sondage. Des approches basées sur les omiques telles que le séquençage des gènes 16sRNA, la métagénomique, la métatranscriptomique, la métabolomique et la métaprotéomique seront également utilisées pour étudier la diversité et la fonction microbiennes.

B) Isoler et caractériser le potentiel pathogène de microbes spécifiques associés aux maladies du foie : L'évaluation microbiologique d'échantillons fécaux nous permettra de dénombrer des microbes spécifiques (bactéries, virus et champignons) à partir d'échantillons en utilisant des techniques de culture microbiologique conventionnelles. Ces isolats seront ensuite identifiés et évalués pour leur potentiel pathogénétique. Cela impliquera une évaluation génomique du pouvoir pathogène en utilisant des techniques telles que le séquençage du génome entier pour caractériser des traits spécifiques. Nous effectuerons également une évaluation métabolomique des microbes pathogènes pour rechercher une altération des voies liées au métabolisme des sels biliaires, de l'alcool et des acides gras à chaîne courte. Cela impliquera une évaluation transcriptomique des souches pathogènes ainsi qu'une chromatographie en phase gazeuse pour étudier les sous-produits de leur métabolisme.

Lot de travaux 2 : Évaluation de la réponse de l'hôte à des microbes spécifiques dans les maladies du foie Ce lot de travaux impliquera la collecte de 30 ml de sang auprès de patients et de témoins. Ce groupe de sujets sera spécifiquement autorisé pour des analyses de sang. Ce sang sera utilisé pour générer des macrophages qui seront nécessaires aux études de provocation. Les microbes pathogènes identifiés dans l'étude 1 seront évalués pour leur potentiel pro-inflammatoire au moyen d'expériences de provocation sur des lignées cellulaires, des organoïdes tissulaires et des modèles animaux expérimentaux. Le sang prélevé au moment du recrutement sera évalué pour détecter la présence de médiateurs inflammatoires suite à une provocation avec des agents infectieux identifiés dans l'étude 1. Le sang total collecté ~ 30 ml (2 cuillères à soupe) aura un panel de cellules bactériennes/virales et fongiques ajoutées et celles-ci seront être incubé pendant 48 heures maximum. Les preuves de développement inflammatoire seront étudiées à l'aide de techniques moléculaires comprenant (mais pas exclusivement) l'ELISA et l'analyse cytométrique en flux. Chez une proportion de sujets, du sang sera prélevé pour extraire les cellules monocytes du sang périphérique (PBMC) afin d'évaluer la réponse immunitaire systémique contre ces agents pathogènes putatifs.

Work package 3 : Caractériser les changements dans le microenvironnement immunitaire hépatique en analysant les biopsies hépatiques des patients. Ce lot de travaux visera à élucider les changements inflammatoires qui se produisent dans le foie en réponse aux agents pathogènes intestinaux. Un petit sous-groupe de patients qui subissent une biopsie hépatique pour des raisons cliniques recevront une petite partie du tissu hépatique au-delà de ce qui est requis à des fins de diagnostic. La plus grande partie sera envoyée pour évaluation pathologique. Cette petite portion excédentaire sera prélevée de la biopsie hépatique par le radiologue et remise immédiatement à un membre de l'équipe de recherche. Celui-ci sera transporté dans un flacon d’azote liquide jusqu’au laboratoire de l’Université d’Aberdeen pour traitement. Les hépatocytes seront ensuite isolés de ces échantillons de biopsie hépatique pour une analyse de séquençage d'ARN unicellulaire (ScRNAseq). Le tissu hépatique sera également utilisé pour effectuer une transcriptomique spatiale qui localisera la zone exacte d'altération métabolique.