간 질환의 미생물 및 숙주 반응 평가 (MILD)

목적과 디자인:

본 연구의 핵심 질문은 간 질환의 발생 및 진행에서 장내 미생물(박테리아, 곰팡이 및 바이러스)의 역할을 밝히는 것입니다. 간 질환에서 장내 미생물의 성질에 변화가 있음을 암시하는 기존 문헌이 많이 있습니다. 그러나 간 질환에서 '장 바이러스'의 구체적인 역할은 여전히 ​​신흥 분야입니다. 내강 내 박테리아 및 곰팡이와의 관계 및 숙주 면역체계와의 상호작용은 간 질환에서 특성화되어야 합니다. 이 연구는 간 질환의 숙주-미생물 역학을 조사하는 것을 목표로 하며, 이는 이러한 질환의 병인에 대한 더 나은 이해로 이어질 뿐만 아니라 진행을 예방하기 위한 치료 중재를 설계하는 데도 도움이 됩니다. 이 제안은 Aberdeen Royal Infirmary의 동료들에 의해 동료 검토를 받았습니다. 연구 결과는 과학 저널 출판과 대중 참여 포럼을 통해 더욱 폭넓게 전파될 것입니다.

신병 모집:

환자는 Peter Brunt 위장관(GI) 및 간 클리닉과 Aberdeen Royal Infirmary의 GI 및 간 병동에서 모집됩니다. 외래 환자에게는 진료 예약 편지와 함께 임상 진료 전에 참가자 정보 시트를 우편으로 보내어 환자가 정보를 이해할 수 있는 충분한 시간을 갖도록 합니다. 진료 예약 시 임상 팀원의 동의를 받고 대변 샘플을 위한 수집 키트가 전달됩니다. 병동에서 치료를 받고 있는 간질환 환자의 경우, 사전 동의를 얻은 후 대변 샘플을 채취합니다. 간질환의 원인과 단계에 관한 정보는 이들 환자의 사례 기록을 통해 정기적으로 수집됩니다. 우리는 또한 시간이 지남에 따라 장내 미생물의 진화를 확인하기 위해 장기간에 걸쳐 환자 하위 그룹으로부터 대변 샘플을 얻고 싶습니다. 우리는 6개월에 걸쳐 2개의 대변 샘플을 추가로 요청할 것입니다. 애버딘 대학교 의학 과학 연구소의 연구실에 이러한 샘플을 전달하는 데 필요한 모든 수집 용기와 정보가 제공됩니다. 마지막으로, 챌린지 연구를 위해 일부 환자(n=25)로부터 혈액 샘플을 요청할 수 있습니다. 이 환자 하위 그룹으로부터 총 30ml의 혈액이 수집됩니다. 이러한 환자들은 임상팀의 구체적 동의를 받게 됩니다.

매우 적은 수의 환자 그룹이 간 생검 목록에 등록될 때 확인됩니다. 이 절차는 진단상의 이유로 또는 간 질환 환자의 특정 집단에서 질병의 단계를 결정하기 위해 수행됩니다. 생검 실시 결정은 컨설턴트 간 전문의가 내립니다. 생검은 계획된 방식으로 당일 단위로 수행됩니다. 환자에게 시술을 받으러 오라는 예약 편지가 발송됩니다. 사전에 정보를 고려할 수 있도록 참가 정보 시트가 이 편지와 함께 발송됩니다. 생검 당일 임상팀의 동의를 받게 됩니다.

간 생검은 자문 방사선 전문의가 수행합니다. 진단 목적에 필요한 양을 초과하는 간 조직의 일부는 주 샘플에서 절단됩니다. 그 부분은 임상 및 병리학적 평가를 위해 실험실로 보내지는 최소 2cm의 간 조직과 함께 0.5cm를 넘지 않아야 합니다. 연구에 사용된 부분은 작업 패키지 3 평가를 위해 액체 질소 플라스크에 담아 애버딘 대학교 연구실로 보관 및 운반됩니다. 그런 다음 단일 세포 RNA 서열 분석(ScRNAseq) 분석을 위해 이러한 샘플에서 세포를 분리합니다. 간 조직은 대사 변화의 정확한 영역을 파악하는 공간 전사체학을 수행하는 데에도 활용됩니다. 이 세포는 조직 오가노이드를 만드는 데에도 사용됩니다.

연구 조정에 도움을 줄 두 명의 간 연구 간호사와 한 명의 간장학 연구원이 있습니다. 예비 환자를 식별하는 데 도움을 줄 5명의 컨설턴트 간 전문의와 전문 등록 담당자가 있습니다. 우리는 더 넓은 연구를 위해 제안된 5년 연구 기간 동안 200개의 간 질환 환자 샘플 세트와 그에 상응하는 수의 적절하게 일치하는 대조군 피험자를 수집할 것으로 예상합니다. 우리는 같은 기간에 간 생검 하위 그룹 연구에 50명의 대상자가 있을 것으로 예상합니다.

통제 대상은 애버딘 대학교와 애버딘 왕립 병원에서 모집된 건강한 자원봉사자가 됩니다. 이 연구는 팜플렛을 통해 광고될 것입니다. 통제 참가자는 연구팀으로부터 연락을 받고 동의를 얻기 24시간 전에 이메일로 보내거나 직접 전달되는 참여 정보 시트를 받게 됩니다. 이를 통해 연구 결과를 읽고 이해할 시간을 갖게 됩니다. 자원봉사자가 연구팀의 구성원을 만나는 첫 번째 심사 회의가 열립니다. 연구에 대한 포함/제외 기준을 충족하는지 확인하기 위해 연령, 체중, 관련 건강 상태 및 정기적인 약물에 대한 세부 사항을 자세히 설명하는 기본 건강 설문지를 작성하라는 요청을 받게 됩니다. 포함 기준을 충족하는 경우 동의서에 서명하라는 요청을 받은 후 공식적으로 연구에 모집됩니다. 그들은 자신의 신원을 익명으로 유지하기 위해 항상 사용되는 연구 번호를 받게 됩니다.

연구에 모집된 모든 환자와 대조군에 대한 피험자 로그는 애버딘 대학의 잠긴 캐비닛에 안전하게 보관됩니다.

방법론

이 연구는 애버딘 대학교(University of Aberdeen), 의학 연구소(Institute of Medical Sciences) 및 Rowett Institute 연구소에서 수행될 예정입니다. 이 연구는 아래 설명된 세 가지 작업 패키지를 통해 간 질환에서 장내 미생물군과 숙주 면역 반응의 역할을 밝히는 것을 목표로 합니다.

작업 패키지 1: 간 질환의 장내 미생물 변화 조사

이 작업 패키지에는 다음 평가를 위해 적격 환자 및 건강한 대조군의 대변 샘플 수집이 포함됩니다.

A) 간 질환 환자의 장내 미생물 변화를 조사하기 위해: 분자 분석을 위해서는 환자로부터 수집한 대변 샘플에서 DNA 및 RNA 추출이 필요합니다. PCR 기반 평가는 미생물 다양성을 연구하기 위해 보편적 접근 방식과 그룹/종별 접근 방식을 모두 사용하여 사용됩니다. PCR 분석 후에는 클론 라이브러리 구성, Sanger 서열 분석 및 프로빙 기반 접근 방식을 포함하여(그러나 이에 국한되지는 않음) 다른 분석 방법을 사용할 수 있습니다. 16sRNA 유전자 시퀀싱, 메타유전체학, 메타전사체학, 대사체학 및 메타프로테오믹스와 같은 오믹스 기반 접근법도 미생물 다양성과 기능을 연구하는 데 사용될 것입니다.

B) 간 질환과 관련된 특정 미생물의 병원성 잠재력을 분리하고 특성화합니다. 대변 샘플의 미생물학적 평가를 통해 기존 미생물학 배양 기술을 사용하여 샘플에서 특정 미생물(박테리아, 바이러스 및 진균)을 열거할 수 있습니다. 그런 다음 이들 분리균을 식별하고 병원성 잠재력을 평가합니다. 여기에는 특정 특성을 특성화하기 위해 전체 게놈 서열 분석과 같은 기술을 활용하는 병원성의 게놈 평가가 포함됩니다. 또한 담즙염, 알코올 및 단쇄지방산 대사와 관련된 경로의 변화를 찾기 위해 병원성 미생물에 대한 대사학적 평가를 수행할 것입니다. 여기에는 병원성 균주에 대한 전사체 평가와 대사 부산물을 연구하기 위한 가스 크로마토그래피가 포함됩니다.

작업 패키지 2: 간 질환의 특정 미생물에 대한 숙주 반응 평가 이 작업 패키지에는 환자와 대조군으로부터 혈액 30ml를 수집하는 작업이 포함됩니다. 이 피험자 그룹은 특히 혈액 검사에 대해 동의를 받습니다. 이 혈액은 챌린지 연구에 필요한 대식세포를 생성하는 데 사용됩니다. 연구 1에서 확인된 병원성 미생물은 세포주, 조직 오가노이드 및 실험 동물 모델에 대한 챌린지 실험을 통해 염증 유발 가능성을 평가할 것입니다. 모집 시 채취한 혈액은 연구 1에서 확인된 감염원으로 공격한 후 염증 매개체의 증거에 대해 평가됩니다. 수집된 전혈 ~ 30ml(2테이블스푼)에는 박테리아/바이러스 및 진균 세포 패널이 추가되며 이는 추가됩니다. 최대 48시간 동안 배양됩니다. 염증 발생의 증거는 ELISA 및 유세포 분석을 포함한(그러나 이에 국한되지는 않음) 분자 기술을 사용하여 연구됩니다. 일부 피험자에서는 혈액을 채취하여 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 추출하여 이러한 추정 병원체에 대한 전신 면역 반응을 평가합니다.

작업 패키지 3: 환자의 간 생검을 분석하여 간 면역 미세환경의 변화를 특성화합니다. 이 작업 패키지는 장 병원체에 반응하여 간 내에서 발생하는 염증 변화를 밝히기 위해 수행됩니다. 임상적인 이유로 간 생검을 받는 소규모 하위 그룹의 환자는 진단 목적에 필요한 것보다 적은 양의 간 조직에 대해 동의를 받게 됩니다. 더 큰 부분은 병리학적 평가를 위해 보내질 것입니다. 이 작은 과잉 부분은 방사선 전문의가 간 생검에서 잘라낸 후 즉시 연구팀 구성원에게 전달할 것입니다. 이는 처리를 위해 액체 질소 플라스크에 담겨 애버딘 대학교 연구실로 운반됩니다. 그런 다음 단일 세포 RNA 염기서열 분석(ScRNAseq)을 위해 간 생검 샘플에서 간세포를 분리합니다. 간 조직은 대사 변화의 정확한 영역을 파악하는 공간 전사체학을 수행하는 데에도 활용됩니다.