Ocena mikroorganizmów i odpowiedzi gospodarza w chorobach wątroby (MILD)

Cel i projekt:

Kluczowym pytaniem tego badania jest wyjaśnienie roli mikroflory jelitowej (bakterii, grzybów i wirusów) w rozwoju i postępie chorób wątroby. Istnieje duża ilość istniejącej literatury sugerującej, że w przypadku chorób wątroby następuje zmiana charakteru drobnoustrojów jelitowych. Jednakże specyficzna rola „wiromu jelitowego” w chorobach wątroby jest wciąż wyłaniającą się dziedziną. W przypadku chorób wątroby należy scharakteryzować jego związek z bakteriami i grzybami w świetle jelita oraz interakcję z układem odpornościowym gospodarza. Celem tego badania jest przyjrzenie się dynamice gospodarz-mikrob w chorobach wątroby, co nie tylko doprowadzi do lepszego zrozumienia patogenezy tych chorób, ale także pomoże w opracowaniu interwencji terapeutycznych zapobiegających postępowi. Propozycja została recenzowana przez kolegów z Aberdeen Royal Infirmary. Wyniki zostaną rozpowszechnione na szerszą skalę poprzez publikacje w czasopismach naukowych i fora zaangażowania publicznego.

Rekrutacja:

Pacjenci będą rekrutowani z kliniki Peter Brunt Gastrointestinal (GI) i wątroby oraz oddziału przewodu pokarmowego i wątroby w Aberdeen Royal Infirmary. Do pacjentów ambulatoryjnych zostaną wysłane pocztą arkusze informacyjne dla uczestników przed wizytą kliniczną wraz z pismem o wizycie w klinice, aby mieli wystarczająco dużo czasu na zrozumienie informacji. Podczas wizyty w klinice otrzymają zgodę członka zespołu klinicznego i otrzymają zestaw do pobrania próbki kału. W przypadku pacjentów z chorobami wątroby leczonych na oddziale pobierzemy próbki kału po uzyskaniu świadomej zgody. Informacje dotyczące przyczyny i stadium choroby wątroby będą rutynowo zbierane z dokumentacji przypadków tych pacjentów. Chcielibyśmy także pobrać próbki kału od podgrupy pacjentów w dłuższym okresie, aby zobaczyć ewolucję mikroflory jelitowej w czasie. Poprosimy o dwie kolejne próbki kału w ciągu sześciu miesięcy. Zapewnione zostaną wszystkie niezbędne pojemniki do pobierania próbek oraz informacje dotyczące dostarczenia tych próbek do laboratorium badawczego w Instytucie Nauk Medycznych Uniwersytetu w Aberdeen. Na koniec możemy poprosić o próbkę krwi od podzbioru pacjentów (n=25) do badań prowokacyjnych. Od tej podgrupy pacjentów zostanie pobrane łącznie 30 ml krwi. Pacjenci ci uzyskają wyraźną zgodę zespołu klinicznego.

Bardzo mała grupa pacjentów zostanie zidentyfikowana, gdy zostaną zakwalifikowani do biopsji wątroby. Procedurę tę przeprowadza się ze względów diagnostycznych lub w celu określenia stopnia zaawansowania choroby w określonej grupie pacjentów z chorobami wątroby. Decyzję o wykonaniu biopsji podejmuje specjalista hepatolog. Biopsję wykonuje się na oddziale dziennym w sposób planowy. Do pacjentów wysyłane jest pismo z zaproszeniem na zabieg. Wraz z tymi pismami zostaną przesłane arkusze informacyjne dotyczące uczestnictwa, w celu wcześniejszego rozważenia tych informacji. Zostaną one wyrażone przez członka zespołu klinicznego w dniu biopsji.

Biopsję wątroby wykonuje konsultant radiolog. Z próbki głównej zostanie odcięta część tkanki wątroby w ilości przekraczającej wymaganą do celów diagnostycznych. Część nie będzie większa niż 0,5 cm, przy czym co najmniej 2 cm tkanki wątroby zostanie przesłane do laboratoriów w celu oceny klinicznej i patologicznej. Część pobrana do badań zostanie zatrzymana i przetransportowana do laboratorium Uniwersytetu w Aberdeen w kolbie z ciekłym azotem w celu oceny pakietu roboczego 3. Komórki zostaną następnie wyizolowane z tych próbek do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (ScRNAseq). Tkanka wątroby zostanie również wykorzystana do przeprowadzenia transkryptomiki przestrzennej, która pozwoli dokładnie zlokalizować obszar zmian metabolicznych. Komórki te posłużą także do tworzenia organoidów tkankowych.

W koordynowaniu badania pomogą dwie pielęgniarki zajmujące się badaniami wątroby oraz pracownik naukowy z hepatologii. W identyfikacji potencjalnych pacjentów pomoże pięciu konsultantów hepatologów i wyspecjalizowanych rejestratorów. Przewidujemy pobranie 200 zestawów próbek pacjentów z chorobami wątroby i odpowiedniej liczby odpowiednio dobranych osób kontrolnych w pięcioletnim okresie badania proponowanym dla szerszego badania. Oczekujemy, że w tym samym okresie 50 pacjentów zostanie objętych badaniem podgrupy biopsji wątroby.

Osobami kontrolnymi będą zdrowi ochotnicy rekrutowani z Uniwersytetu w Aberdeen i Aberdeen Royal Infirmary. Reklama badania będzie odbywać się w broszurach. Zespół badawczy skontaktuje się z uczestnikami kontroli i otrzyma karty informacyjne uczestnictwa, które zostaną przesłane e-mailem lub przekazane osobiście na 24 godziny przed uzyskaniem zgody. Dzięki temu będą mieli czas na przeczytanie i zrozumienie badania. Odbędzie się wstępne spotkanie przesiewowe, podczas którego wolontariusz spotka się z członkiem zespołu badawczego. Zostaną poproszeni o wypełnienie podstawowego kwestionariusza stanu zdrowia, zawierającego szczegółowe informacje o wieku, wadze i szczegółach wszelkich istotnych schorzeń oraz regularnie przyjmowanych lekach, aby upewnić się, że spełniają kryteria włączenia/wyłączenia z badania. Jeśli spełnią kryteria włączenia, zostaną poproszeni o podpisanie formularza zgody, a następnie zostaną formalnie zrekrutowani do badania. Otrzymają numer badania, który będzie używany przez cały czas w celu zachowania anonimowości.

Dla wszystkich pacjentów i kontroli włączonych do badania prowadzony będzie dziennik uczestników, który będzie bezpiecznie przechowywany w zamkniętej szafce na Uniwersytecie w Aberdeen.

Metodologia

Badanie zostanie przeprowadzone w laboratoriach badawczych Uniwersytetu w Aberdeen, Instytutu Nauk Medycznych i Instytutu Rowett. Celem badania jest wyjaśnienie roli mikroflory jelitowej i odpowiedzi immunologicznej gospodarza w chorobie wątroby poprzez trzy pakiety prac opisane poniżej:

Pakiet roboczy 1: Badanie zmian mikroflory jelitowej w chorobach wątroby

Ten pakiet roboczy obejmuje pobieranie próbek kału od kwalifikujących się pacjentów i zdrowych pacjentów do celów następujących ocen:

A) Aby zbadać zmiany w mikroflorze jelitowej u pacjentów z chorobami wątroby: Analizy molekularne będą wymagały ekstrakcji DNA i RNA z próbek kału pobranych od pacjentów. Ocena oparta na PCR zostanie zastosowana przy zastosowaniu zarówno podejścia uniwersalnego, jak i podejścia ukierunkowanego na grupę/gatunek, w celu badania różnorodności drobnoustrojów. Po analizie PCR można zastosować inne metody analityczne, w tym (ale nie wyłącznie) konstrukcję biblioteki klonów i sekwencjonowanie Sangera, a także podejścia oparte na sondowaniu. Podejścia oparte na omikach, takie jak sekwencjonowanie genu 16sRNA, metagenomika, metatranskryptomika, metabolomika i metaproteomika, zostaną również wykorzystane do badania różnorodności i funkcji drobnoustrojów.

B) Izolowanie i scharakteryzowanie potencjału chorobotwórczego określonych drobnoustrojów związanych z chorobami wątroby: Mikrobiologiczna ocena próbek kału pozwoli nam na wyliczenie konkretnych drobnoustrojów (bakterii, wirusów i grzybów) z próbek przy użyciu konwencjonalnych technik hodowli mikrobiologicznej. Izolaty te zostaną następnie zidentyfikowane i ocenione pod kątem ich potencjału patogenetycznego. Będzie to obejmować genomową ocenę patogeniczności z wykorzystaniem technik takich jak sekwencjonowanie całego genomu w celu scharakteryzowania określonych cech. Przeprowadzimy również ocenę metabolomiczną drobnoustrojów chorobotwórczych, aby poszukać zmian w szlakach związanych z metabolizmem soli żółciowych, alkoholu i krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Będzie to obejmować ocenę transkryptomiczną szczepów chorobotwórczych, a także chromatografię gazową w celu zbadania produktów ubocznych ich metabolizmu.

Pakiet roboczy 2: Ocena odpowiedzi gospodarza na określone drobnoustroje w chorobach wątroby. Ten pakiet roboczy będzie obejmował pobranie 30 ml krwi od pacjentów i grupy kontrolnej. Ta grupa pacjentów zostanie specjalnie upoważniona do badania krwi. Krew ta zostanie wykorzystana do wytworzenia makrofagów, które będą potrzebne do badań prowokacyjnych. Drobnoustroje chorobotwórcze zidentyfikowane w Badaniu 1 zostaną ocenione pod kątem ich potencjału prozapalnego w drodze eksperymentów prowokacyjnych na liniach komórkowych, organoidach tkankowych i doświadczalnych modelach zwierzęcych. Krew pobrana w momencie rekrutacji zostanie oceniona pod kątem obecności mediatorów stanu zapalnego po prowokacji czynnikami zakaźnymi zidentyfikowanymi w Badaniu 1. Pobrana krew pełna ~ 30 ml (2 łyżki stołowe) będzie zawierała panel komórek bakteryjnych/wirusowych i grzybów, które będą inkubować do 48 godzin. Dowody rozwoju stanu zapalnego będą badane przy użyciu technik molekularnych, w tym (ale nie wyłącznie) testu ELISA i analizy cytometrii przepływowej. Od części pacjentów zostanie pobrana krew w celu ekstrakcji monocytów krwi obwodowej (PBMC) w celu oceny ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej przeciwko tym domniemanym patogenom.

Pakiet zadań 3: Scharakteryzowanie zmian w mikrośrodowisku odpornościowym wątroby poprzez analizę biopsji wątroby od pacjentów. Ten pakiet prac zostanie przeprowadzony w celu wyjaśnienia zmian zapalnych zachodzących w wątrobie w odpowiedzi na patogeny jelitowe. Niewielka podgrupa pacjentów poddawanych biopsji wątroby ze względów klinicznych uzyska zgodę na pobranie niewielkiej części tkanki wątroby w ilości przekraczającej ilość wymaganą do celów diagnostycznych. Większa część zostanie wysłana do oceny patologicznej. Ten niewielki nadmiar zostanie odcięty z biopsji wątroby przez radiologa i natychmiast przekazany członkowi zespołu badawczego. Zostanie ono przetransportowane w kolbie z ciekłym azotem do laboratorium Uniwersytetu w Aberdeen w celu przetworzenia. Z próbek biopsji wątroby zostaną następnie wyizolowane hepatocyty do analizy sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek (ScRNAseq). Tkanka wątroby zostanie również wykorzystana do przeprowadzenia transkryptomiki przestrzennej, która pozwoli dokładnie zlokalizować obszar zmian metabolicznych.