Hodnocení mikroorganismů a reakce hostitele u onemocnění jater (MILD)

Účel a design:

Klíčovou otázkou této výzkumné studie je objasnit roli střevní mikroflóry (bakterie, plísně a viry) ve vývoji a progresi onemocnění jater. Existuje velké množství existující literatury, která naznačuje, že u onemocnění jater dochází ke změně povahy střevních mikrobů. Specifická úloha „střevního viromu“ při onemocnění jater je však stále nově vznikající oblastí. Jeho vztah k bakteriím a houbám v lumen a interakci s imunitním systémem hostitele je třeba charakterizovat u onemocnění jater. Tato studie si klade za cíl podívat se na dynamiku hostitel-mikrobi u onemocnění jater, což povede nejen k lepšímu pochopení patogeneze těchto onemocnění, ale také pomůže při navrhování terapeutických intervencí k prevenci progrese. Návrh byl posouzen kolegy z Aberdeen Royal Infirmary. Širší šíření výsledků bude probíhat prostřednictvím publikací ve vědeckých časopisech a prostřednictvím fór pro zapojení veřejnosti.

Nábor:

Pacienti se budou rekrutovat z Gastrointestinální (GI) a jaterní kliniky Petera Brunta a GI a jaterního oddělení v Aberdeen Royal Infirmary. Ambulantním pacientům budou před klinickou návštěvou zaslány e-mailem informační listy pro účastníky spolu s jejich jmenovacím dopisem na kliniku, aby měli dostatek času na pochopení informací. Při schůzce na klinice obdrží souhlas od člena klinického týmu a předá jim odběrovou soupravu pro vzorek stolice. U pacientů s onemocněním jater, kteří jsou léčeni na oddělení, odebereme vzorky stolice po obdržení informovaného souhlasu. Informace týkající se příčiny a stádia onemocnění jater budou rutinně shromažďovány ze záznamů případů těchto pacientů. Rádi bychom také získali vzorky stolice od podskupiny pacientů v delším časovém horizontu, abychom viděli vývoj střevní mikroflóry v průběhu času. Během šesti měsíců si vyžádáme další dva vzorky trusu. Budou poskytnuty všechny potřebné sběrné nádoby a informace pro doručení těchto vzorků do výzkumné laboratoře Institutu lékařských věd Univerzity v Aberdeenu. Nakonec můžeme požádat o vzorek krve od podskupiny pacientů (n=25) pro provokační studie. Této podskupině pacientů bude odebráno celkem 30 ml krve. Tito pacienti budou výslovně schváleni klinickým týmem.

Při zařazení na jaterní biopsii bude identifikována velmi malá skupina pacientů. Tento postup se provádí z diagnostických důvodů nebo pro stádium onemocnění u specifické kohorty pacientů s onemocněním jater. Rozhodnutí o provedení biopsie přijímá jejich konzultant hepatolog. Biopsie se provádí na denní jednotce plánovaným způsobem. Pacientům je zaslán objednací dopis, aby se dostavili na zákrok. Spolu s těmito dopisy budou zaslány informační listy k účasti, aby bylo možné předem zvážit informace. Souhlasí s nimi člen klinického týmu v den biopsie.

Biopsii jater provádí konzultant radiolog. Z hlavního vzorku bude odříznuta část jaterní tkáně, která převyšuje množství vyžadované pro diagnostické účely. Část nebude větší než 0,5 cm s alespoň 2 cm jaterní tkáně odeslané do laboratoří ke klinickému a patologickému posouzení. Část odebraná pro výzkum bude uchovávána a přepravena do laboratoře University of Aberdeen v baňce s tekutým dusíkem pro posouzení pracovního balíčku 3. Buňky pak budou izolovány z těchto vzorků pro analýzu jednobuněčné RNA sekvenční analýzy (ScRNAseq). Jaterní tkáň bude také využita k provádění prostorové transkriptomiky, která bude lokalizovat přesnou oblast metabolických změn. Tyto buňky budou také použity k vytvoření tkáňových organoidů.

Existují dvě sestry zabývající se výzkumem jater a výzkumný pracovník hepatologie, kteří pomohou při koordinaci studie. Existuje pět konzultantů hepatologů a odborných registrátorů, kteří pomohou s identifikací potenciálních pacientů. Očekávali bychom sběr 200 souborů vzorků pacientů s onemocněním jater a odpovídající počet odpovídajících kontrolních subjektů během pětiletého navrhovaného období studie pro širší studii. Očekávali bychom 50 subjektů pro podskupinovou studii jaterní biopsie ve stejném časovém období.

Kontrolní subjekty budou zdraví dobrovolníci přijatí z University of Aberdeen a Aberdeen Royal Infirmary. Studie bude inzerována prostřednictvím letáků. Účastníci kontroly budou kontaktováni výzkumným týmem a budou jim předány informační listy o účasti, které budou zaslány e-mailem nebo předány osobně 24 hodin před získáním souhlasu. To zajistí, že budou mít čas si výzkumnou studii přečíst a porozumět jí. Proběhne úvodní screeningové setkání, během kterého se dobrovolník setká s členem výzkumného týmu. Budou požádáni, aby vyplnili základní zdravotní dotazník s uvedením věku, hmotnosti a podrobností o všech relevantních zdravotních stavech a pravidelné medikaci, aby bylo zajištěno, že splňují kritéria pro zařazení/vyloučení ze studie. Pokud splňují kritéria pro zařazení, budou požádáni, aby podepsali formulář souhlasu, a poté budou formálně přijati do studie. Bude jim přiděleno číslo studie, které bude vždy použito k zachování anonymity jejich identity.

Pro všechny pacienty a kontroly přijaté do studie bude veden záznam subjektu, který bude bezpečně uložen v uzamčené skříni na University of Aberdeen.

Metodologie

Studie bude provedena ve výzkumných laboratořích University of Aberdeen, Institute of Medical Sciences a Rowett Institute. Cílem studie je objasnit roli střevní mikroflóry a imunitní reakce hostitele při onemocnění jater prostřednictvím tří pracovních balíčků, jak je popsáno níže:

Pracovní balíček 1: Výzkum alterace střevní mikroflóry u onemocnění jater

Tento pracovní balíček zahrnuje odběr vzorků stolice od vhodných pacientů a zdravých kontrol pro následující hodnocení:

A) Prozkoumat změnu střevní mikroflóry u pacientů s onemocněním jater: Molekulární analýzy budou vyžadovat extrakci DNA a RNA ze vzorků stolice odebraných pacientům. Ke studiu mikrobiální diverzity bude použito hodnocení založené na PCR s využitím jak univerzálních, tak skupinově/druhově zaměřených přístupů. Po analýze PCR mohou být použity další analytické metody včetně (ale ne výhradně) konstrukce knihovny klonů a Sangerova sekvenování a také přístupů založených na sondování. Ke studiu mikrobiální diverzity a funkce budou také použity přístupy založené na omice, jako je sekvenování genů 16sRNA, metagenomika, metatranskriptomika, metabolomika a metaproteomika.

B) Izolujte a charakterizujte patogenní potenciál specifických mikrobů, kteří jsou spojeni s onemocněními jater: Mikrobiologické hodnocení vzorků stolice nám umožní vyčíslit specifické mikroby (bakterie, viry a houby) ze vzorků pomocí konvenčních mikrobiologických kultivačních technik. Tyto izoláty pak budou identifikovány a hodnoceny z hlediska jejich patogenetického potenciálu. To bude zahrnovat genomické hodnocení patogenity s využitím technik, jako je sekvenování celého genomu k charakterizaci specifických znaků. Provedeme také metabolomické hodnocení patogenních mikrobů, abychom hledali změny v drahách týkajících se metabolismu žlučových solí, alkoholu a mastných kyselin s krátkým řetězcem. To bude zahrnovat transkriptomické hodnocení patogenních kmenů a také plynovou chromatografii pro studium vedlejších produktů jejich metabolismu.

Pracovní balíček 2: Hodnocení reakce hostitele na specifické mikroby u onemocnění jater Tento pracovní balíček bude zahrnovat odběr 30 ml krve od pacientů a kontrol. Tato skupina subjektů bude schválena speciálně pro testování krve. Tato krev bude použita ke generování makrofágů, které budou potřeba pro provokační studie. Patogenní mikroby identifikované ve studii 1 budou hodnoceny z hlediska jejich prozánětlivého potenciálu prostřednictvím provokačních experimentů na buněčných liniích, tkáňových organoidech a experimentálních zvířecích modelech. Krev odebraná v době náboru bude hodnocena na přítomnost zánětlivých mediátorů po expozici infekčním agens identifikovaným ve studii 1. Celá krev odebraná ~ 30 ml (2 polévkové lžíce) bude obsahovat panel bakteriálních/virových a plísňových buněk a ty budou inkubovat po dobu až 48 hodin. Důkazy o rozvoji zánětu budou studovány pomocí molekulárních technik včetně (ale ne výhradně) ELISA a analýzy průtokové cytometrie. U části subjektů bude odebrána krev k extrakci monocytových buněk periferní krve (PBMC) k posouzení systémové imunitní reakce proti těmto domnělým patogenům.

Pracovní balíček 3: Charakterizujte změny v imunitním mikroprostředí jater pomocí analýzy jaterních biopsií pacientů. Tento pracovní balíček bude proveden za účelem objasnění zánětlivých změn, které se vyskytují v játrech v reakci na střevní patogeny. Malá podskupina pacientů, kteří podstupují jaterní biopsii z klinických důvodů, bude mít souhlas s odběrem malé části jaterní tkáně nad rámec toho, co je požadováno pro diagnostické účely. Větší část bude odeslána k patologickému posouzení. Tuto malou přebytečnou část radiolog odřízne z jaterní biopsie a okamžitě ji předá členovi výzkumného týmu. To bude přepraveno v baňce s tekutým dusíkem do laboratoře University of Aberdeen ke zpracování. Hepatocyty budou poté izolovány z těchto vzorků jaterní biopsie pro analýzu sekvenování jednobuněčné RNA (ScRNAseq). Jaterní tkáň bude také využita k provádění prostorové transkriptomiky, která bude lokalizovat přesnou oblast metabolických změn.