Bewertung von Mikroorganismen und Wirtsreaktionen bei Lebererkrankungen (MILD)

Zweck und Design:

Die Schlüsselfrage dieser Forschungsstudie besteht darin, die Rolle der Darmmikrobiota (Bakterien, Pilze und Viren) bei der Entwicklung und dem Fortschreiten von Lebererkrankungen aufzuklären. Es gibt eine große Menge vorhandener Literatur, die darauf hindeutet, dass es bei Lebererkrankungen zu einer Veränderung in der Natur der Darmmikroben kommt. Die spezifische Rolle des „Darmviroms“ bei Lebererkrankungen ist jedoch noch ein neues Gebiet. Seine Beziehung zu den Bakterien und Pilzen im Lumen und die Interaktion mit dem Immunsystem des Wirts müssen bei Lebererkrankungen charakterisiert werden. Diese Studie zielt darauf ab, die Wirt-Mikroben-Dynamik bei Lebererkrankungen zu untersuchen, was nicht nur zu einem besseren Verständnis der Pathogenese dieser Krankheiten führen wird, sondern auch bei der Entwicklung therapeutischer Interventionen zur Verhinderung eines Fortschreitens helfen wird. Der Vorschlag wurde von Kollegen des Aberdeen Royal Infirmary begutachtet. Eine breitere Verbreitung der Ergebnisse erfolgt durch Veröffentlichungen in wissenschaftlichen Fachzeitschriften und durch öffentliche Engagement-Foren.

Rekrutierung:

Die Patienten werden aus der Peter Brunt Gastrointestinal (GI)- und Leberklinik sowie der GI- und Leberstation des Aberdeen Royal Infirmary rekrutiert. Teilnehmern ambulanter Behandlung werden vor ihrem klinischen Besuch zusammen mit ihrem Klinikterminbrief per Post Teilnehmerinformationsblätter zugesandt, damit sie genügend Zeit haben, die Informationen zu verstehen. Bei ihrem Termin in der Klinik erhalten sie die Zustimmung eines Mitglieds des klinischen Teams und es wird ihnen ein Entnahmeset für eine Stuhlprobe ausgehändigt. Bei Patienten mit Lebererkrankungen, die auf der Station behandelt werden, sammeln wir nach Einholung der Einverständniserklärung Stuhlproben. Informationen zu Ursache und Stadium der Lebererkrankung werden routinemäßig aus den Fallakten dieser Patienten gesammelt. Wir möchten auch über einen längeren Zeitraum Stuhlproben von einer Untergruppe von Patienten entnehmen, um die Entwicklung der Darmmikrobiota im Laufe der Zeit zu verfolgen. Wir werden über einen Zeitraum von sechs Monaten zwei weitere Stuhlproben anfordern. Alle notwendigen Sammelbehälter und Informationen für die Lieferung dieser Proben an das Forschungslabor am Institute of Medical Sciences der University of Aberdeen werden bereitgestellt. Schließlich können wir für Provokationsstudien eine Blutprobe von einer Untergruppe von Patienten (n=25) anfordern. Insgesamt werden 30 ml Blut dieser Untergruppe von Patienten entnommen. Diesen Patienten wird vom klinischen Team ausdrücklich zugestimmt.

Eine sehr kleine Gruppe von Patienten wird identifiziert, wenn sie für eine Leberbiopsie aufgeführt werden. Dieses Verfahren wird aus diagnostischen Gründen oder zur Einstufung der Erkrankung in einer bestimmten Kohorte von Patienten mit Lebererkrankungen durchgeführt. Die Entscheidung zur Durchführung der Biopsie wird von Ihrem beratenden Hepatologen getroffen. Die Biopsie wird planmäßig in einer Tagesstation durchgeführt. Den Patienten wird ein Terminschreiben zugeschickt, damit sie zum Eingriff erscheinen können. Die Teilnahmeinformationsblätter werden zusammen mit diesen Briefen verschickt, um die Informationen vorab zu berücksichtigen. Sie werden am Tag der Biopsie von einem Mitglied des klinischen Teams genehmigt.

Die Leberbiopsie wird von einem beratenden Radiologen durchgeführt. Von der Hauptprobe wird ein Teil des Lebergewebes abgeschnitten, der über den für diagnostische Zwecke erforderlichen Umfang hinausgeht. Die Portion darf nicht mehr als 0,5 cm betragen, wobei mindestens 2 cm Lebergewebe zur klinischen und pathologischen Beurteilung an die Labore geschickt werden. Der für die Forschung entnommene Teil wird aufbewahrt und in einem Flüssigstickstoffkolben zur Bewertung des Arbeitspakets 3 zum Labor der University of Aberdeen transportiert. Aus diesen Proben werden dann Zellen für die Analyse der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (ScRNAseq) isoliert. Lebergewebe wird auch zur Durchführung räumlicher Transkriptomik genutzt, die den genauen Bereich der Stoffwechselveränderung lokalisieren wird. Diese Zellen werden auch zur Herstellung von Gewebeorganoiden verwendet.

Es gibt zwei Krankenschwestern für Leberforschung und einen Hepatologie-Forschungsmitarbeiter, die bei der Koordinierung der Studie helfen werden. Es gibt fünf beratende Hepatologen und spezialisierte Registrare, die bei der Identifizierung potenzieller Patienten behilflich sein werden. Wir gehen davon aus, dass während des vorgeschlagenen fünfjährigen Untersuchungszeitraums für die umfassendere Studie 200 Probensätze von Patienten mit Lebererkrankungen und eine entsprechende Anzahl entsprechend angepasster Kontrollpersonen gesammelt werden. Wir gehen davon aus, dass im gleichen Zeitraum 50 Probanden an der Leberbiopsie-Untergruppenstudie teilnehmen werden.

Kontrollpersonen werden gesunde Freiwillige sein, die von der University of Aberdeen und dem Aberdeen Royal Infirmary rekrutiert wurden. Die Studie wird durch Broschüren beworben. Die Kontrollteilnehmer werden vom Forschungsteam kontaktiert und erhalten die Teilnahmeinformationsblätter, die 24 Stunden vor Einholung der Einwilligung per E-Mail verschickt oder persönlich übergeben werden. Dadurch wird sichergestellt, dass sie Zeit haben, die Forschungsstudie zu lesen und zu verstehen. Es findet ein erstes Screening-Treffen statt, bei dem der Freiwillige ein Mitglied des Forschungsteams trifft. Um sicherzustellen, dass sie die Einschluss-/Ausschlusskriterien für die Studie erfüllen, werden sie gebeten, einen grundlegenden Gesundheitsfragebogen auszufüllen, in dem sie Angaben zu Alter, Gewicht und Angaben zu allen relevanten Gesundheitszuständen und regelmäßigen Medikamenten enthalten. Wenn sie die Einschlusskriterien erfüllen, werden sie gebeten, eine Einverständniserklärung zu unterzeichnen und werden dann offiziell in die Studie aufgenommen. Sie erhalten eine Studiennummer, die jederzeit verwendet wird, um ihre Identität anonym zu halten.

Für alle in die Studie rekrutierten Patienten und Kontrollpersonen wird ein Probandenprotokoll geführt, das sicher in einem verschlossenen Schrank an der Universität Aberdeen aufbewahrt wird.

Methodik

Die Studie wird in den Forschungslabors der University of Aberdeen, des Institute of Medical Sciences und des Rowett Institute durchgeführt. Die Studie zielt darauf ab, die Rolle der Darmmikrobiota und der Immunantwort des Wirts bei Lebererkrankungen durch drei Arbeitspakete aufzuklären, wie unten beschrieben:

Arbeitspaket 1: Untersuchung der Veränderung der Darmmikrobiota bei Lebererkrankungen

Dieses Arbeitspaket umfasst die Sammlung von Stuhlproben von geeigneten Patienten und gesunden Kontrollpersonen für die folgenden Beurteilungen:

A) Um die Veränderung der Darmmikrobiota bei Patienten mit Lebererkrankungen zu untersuchen: Für molekulare Analysen ist die Extraktion von DNA und RNA aus Stuhlproben von Patienten erforderlich. Zur Untersuchung der mikrobiellen Vielfalt wird eine PCR-basierte Bewertung sowohl mit universellen als auch mit gruppen-/artenspezifischen Ansätzen eingesetzt. Nach der PCR-Analyse können andere Analysemethoden eingesetzt werden, darunter (aber nicht ausschließlich) der Aufbau einer Klonbibliothek und die Sanger-Sequenzierung sowie sondierungsbasierte Ansätze. Omics-basierte Ansätze wie 16sRNA-Gensequenzierung, Metagenomik, Metatranskriptomik, Metabolomik und Metaproteomik werden ebenfalls verwendet, um die Vielfalt und Funktion von Mikroben zu untersuchen.

B) Isolieren und charakterisieren Sie das pathogene Potenzial spezifischer Mikroben, die mit Lebererkrankungen in Zusammenhang stehen: Die mikrobiologische Untersuchung von Stuhlproben wird es uns ermöglichen, spezifische Mikroben (Bakterien, Viren und Pilze) aus Proben mithilfe herkömmlicher mikrobiologischer Kulturtechniken zu zählen. Diese Isolate werden dann identifiziert und auf ihr pathogenetisches Potenzial hin bewertet. Dazu gehört die genomische Beurteilung der Pathogenität mithilfe von Techniken wie der Sequenzierung des gesamten Genoms zur Charakterisierung spezifischer Merkmale. Wir werden auch eine metabolische Untersuchung pathogener Mikroben durchführen, um nach Veränderungen in Signalwegen im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel von Gallensalzen, Alkohol und kurzkettigen Fettsäuren zu suchen. Dies umfasst die transkriptomische Bewertung der pathogenen Stämme sowie die Gaschromatographie zur Untersuchung der Nebenprodukte ihres Stoffwechsels.

Arbeitspaket 2: Bewertung der Reaktion des Wirts auf bestimmte Mikroben bei Lebererkrankungen. Dieses Arbeitspaket umfasst die Entnahme von 30 ml Blut von Patienten und Kontrollpersonen. Diese Probandengruppe wird speziell für die Blutuntersuchung zugelassen. Dieses Blut wird zur Erzeugung von Makrophagen verwendet, die für die Challenge-Studien benötigt werden. In Studie 1 identifizierte pathogene Mikroben werden durch Challenge-Experimente an Zelllinien, Gewebeorganoiden und experimentellen Tiermodellen auf ihr entzündungsförderndes Potenzial untersucht. Zum Zeitpunkt der Rekrutierung entnommenes Blut wird nach der Belastung mit in Studie 1 identifizierten Infektionserregern auf Hinweise auf Entzündungsmediatoren untersucht. Vollblut, das ~ 30 ml (2 Esslöffel) entnommen wird, wird mit einer Reihe von Bakterien-/Virus- und Pilzzellen versetzt und diese werden hinzugefügt bis zu 48 Stunden inkubiert werden. Der Nachweis einer entzündlichen Entwicklung wird mithilfe molekularer Techniken untersucht, einschließlich (aber nicht ausschließlich) ELISA und durchflusszytometrischer Analyse. Bei einem Teil der Probanden wird Blut entnommen, um periphere Blutmonozytenzellen (PBMCs) zu extrahieren, um die systemische Immunantwort gegen diese mutmaßlichen Krankheitserreger zu beurteilen.

Arbeitspaket 3: Charakterisierung der Veränderungen in der Immunmikroumgebung der Leber durch Analyse von Leberbiopsien von Patienten. Dieses Arbeitspaket wird durchgeführt, um die entzündlichen Veränderungen aufzuklären, die in der Leber als Reaktion auf die Darmpathogene auftreten. Einer kleinen Untergruppe von Patienten, die sich aus klinischen Gründen einer Leberbiopsie unterziehen, wird die Entnahme eines kleinen Teils des Lebergewebes gestattet, der über das für diagnostische Zwecke erforderliche Maß hinausgeht. Der größere Teil wird zur pathologischen Beurteilung geschickt. Dieser kleine überschüssige Teil wird vom Radiologen aus der Leberbiopsie abgeschnitten und umgehend einem Mitglied des Forschungsteams übergeben. Dieses wird in einem Flüssigstickstoffkolben zur Verarbeitung zum Labor der Universität Aberdeen transportiert. Aus diesen Leberbiopsieproben werden dann Hepatozyten für die Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalyse (ScRNAseq) isoliert. Lebergewebe wird auch zur Durchführung räumlicher Transkriptomik genutzt, die den genauen Bereich der Stoffwechselveränderung lokalisieren wird.