Beoordeling van micro-organismen en gastheerrespons bij leverziekten (MILD)

Doel en ontwerp:

De centrale vraag van dit onderzoek is het ophelderen van de rol van de darmmicrobiota (bacteriën, schimmels en virussen) in de ontwikkeling en progressie van leverziekten. Er is een grote hoeveelheid bestaande literatuur die suggereert dat er een verandering is in de aard van de darmmicroben bij leverziekten. De specifieke rol van het ‘darmvirus’ bij leverziekten is echter nog steeds een opkomend terrein. De relatie ervan met de bacteriën en schimmels in het lumen en de interactie met het immuunsysteem van de gastheer moeten bij leverziekten worden gekarakteriseerd. Deze studie heeft tot doel te kijken naar de gastheer-microbe-dynamiek bij leverziekten, wat niet alleen zal leiden tot een beter begrip van de pathogenese van deze ziekten, maar ook zal helpen bij het ontwerpen van therapeutische interventies om progressie te voorkomen. Het voorstel is door collega's van de Aberdeen Royal Infirmary beoordeeld. Een bredere verspreiding van de resultaten zal plaatsvinden via publicaties in wetenschappelijke tijdschriften en via forums voor publieke betrokkenheid.

Werving:

Patiënten zullen worden gerekruteerd uit de Peter Brunt Gastro-intestinale (GI) en Leverkliniek, en de GI- en leverafdeling van de Aberdeen Royal Infirmary. Poliklinische deelnemers ontvangen vóór hun klinische aanwezigheid per post deelnemersinformatiebladen, samen met hun afspraakbrief in de kliniek, zodat ze voldoende tijd hebben om de informatie te begrijpen. Bij hun afspraak in de kliniek krijgen ze toestemming van een lid van het klinische team en wordt er een verzamelkit overhandigd voor een fecaal monster. Bij patiënten met een leverziekte die op de afdeling worden behandeld, verzamelen wij fecesmonsters nadat geïnformeerde toestemming is verkregen. Informatie over de oorzaak en het stadium van de leverziekte zal routinematig worden verzameld uit de dossiers van deze patiënten. We zouden ook graag ontlastingsmonsters willen verkrijgen van een subgroep patiënten over een langere periode om de evolutie van de darmmicrobiota in de loop van de tijd te zien. Over een periode van zes maanden vragen wij nog twee fecesmonsters aan. Alle benodigde verzamelcontainers en informatie voor de levering van deze monsters aan het onderzoekslaboratorium van het Institute of Medical Sciences, University of Aberdeen zullen worden verstrekt. Ten slotte kunnen we een bloedmonster aanvragen bij een subgroep van patiënten (n=25) voor challenge-onderzoeken. Bij deze subgroep patiënten wordt in totaal 30 ml bloed afgenomen. Voor deze patiënten zal specifiek toestemming worden verleend door het klinische team.

Een zeer kleine groep patiënten zal worden geïdentificeerd wanneer zij worden aangemeld voor een leverbiopsie. Deze procedure wordt uitgevoerd om diagnostische redenen of om de ziekte in een specifiek cohort van patiënten met een leverziekte te stadium. De beslissing om de biopsie uit te voeren wordt genomen door hun hepatoloog-adviseur. De biopsie gebeurt op een geplande manier op een dagopname. De patiënten krijgen een afspraakbrief toegestuurd om langs te komen voor de procedure. Met deze brieven worden de deelname-informatiebladen meegestuurd, zodat de informatie vooraf kan worden overwogen. Ze zullen op de dag van de biopsie worden goedgekeurd door een lid van het klinische team.

De leverbiopsie wordt uitgevoerd door een radioloogconsulent. Een deel van het leverweefsel dat groter is dan nodig is voor diagnostische doeleinden, wordt van het hoofdmonster afgesneden. Het gedeelte zal niet groter zijn dan 0,5 cm, waarbij ten minste 2 cm leverweefsel naar de laboratoria wordt gestuurd voor klinische en pathologische beoordeling. Het deel dat voor onderzoek wordt afgenomen, wordt bewaard en in een fles met vloeibare stikstof naar het laboratorium van de Universiteit van Aberdeen getransporteerd voor beoordeling van werkpakket 3. Cellen zullen vervolgens uit deze monsters worden geïsoleerd voor analyse van single-cell RNA-sequencing (ScRNAseq). Leverweefsel zal ook worden gebruikt om ruimtelijke transcriptomics uit te voeren die het exacte gebied van metabolische verandering zullen lokaliseren. Deze cellen zullen ook worden gebruikt om weefselorganoïden te maken.

Er zijn twee leveronderzoekverpleegkundigen en een onderzoeker Hepatologie die zullen helpen bij het coördineren van het onderzoek. Er zijn vijf hepatologen-consultants en gespecialiseerde registrars die zullen helpen bij het identificeren van potentiële patiënten. We verwachten de verzameling van 200 monstersets van leverziektepatiënten en een corresponderend aantal op passende wijze gematchte controlepersonen gedurende de voorgestelde vijfjarige onderzoeksperiode voor het bredere onderzoek. We verwachten dat er in dezelfde periode 50 proefpersonen zullen deelnemen aan het leverbiopsie-subgroeponderzoek.

Controlepersonen zullen gezonde vrijwilligers zijn die zijn gerekruteerd van de Universiteit van Aberdeen en de Aberdeen Royal Infirmary. Het onderzoek zal via pamfletten worden aangekondigd. De controledeelnemers worden gecontacteerd door het onderzoeksteam en ontvangen de deelname-informatiebladen die per e-mail worden verzonden of persoonlijk worden overhandigd, 24 uur voordat toestemming wordt verkregen. Dit zorgt ervoor dat ze tijd hebben om het onderzoek te lezen en te begrijpen. Er vindt een eerste screeningbijeenkomst plaats, waarbij de vrijwilliger een lid van het onderzoeksteam ontmoet. Zij zullen worden gevraagd een basisgezondheidsvragenlijst in te vullen waarin leeftijd, gewicht en details van eventuele relevante gezondheidsproblemen en reguliere medicatie worden vermeld om ervoor te zorgen dat zij voldoen aan de inclusie-/uitsluitingscriteria voor het onderzoek. Als ze aan de inclusiecriteria voldoen, wordt hen gevraagd een toestemmingsformulier te ondertekenen en worden ze vervolgens formeel voor het onderzoek gerekruteerd. Zij krijgen een studienummer dat te allen tijde wordt gebruikt om hun identiteit anoniem te houden.

Er zal een subjectlogboek worden bijgehouden voor alle patiënten en controlepersonen die in het onderzoek zijn gerekruteerd, dat veilig zal worden bewaard in een afgesloten kast op de Universiteit van Aberdeen.

Methodologie

Het onderzoek zal worden uitgevoerd in de onderzoekslaboratoria van de Universiteit van Aberdeen, het Institute of Medical Sciences en het Rowett Institute. Het onderzoek heeft tot doel de rol van de darmmicrobiota en de immuunrespons van de gastheer bij leverziekten op te helderen door middel van drie werkpakketten, zoals hieronder beschreven:

Werkpakket 1: Onderzoek naar de verandering van de darmmicrobiota bij leverziekten

Dit werkpakket omvat het verzamelen van fecale monsters van in aanmerking komende patiënten en gezonde controles voor de volgende beoordelingen:

A) Om de verandering van de darmmicrobiota bij patiënten met leverziekten te onderzoeken: Voor moleculaire analyses is DNA- en RNA-extractie nodig uit fecale monsters die van patiënten zijn verzameld. Op PCR gebaseerde beoordeling zal worden toegepast met behulp van zowel universele als groeps-/soortgerichte benaderingen om de microbiële diversiteit te bestuderen. Na PCR-analyse kunnen andere analytische methoden worden gebruikt, waaronder (maar niet uitsluitend) de constructie van kloonbibliotheken en Sanger-sequencing en ook op probes gebaseerde benaderingen. Op omics gebaseerde benaderingen zoals 16sRNA-gensequencing, metagenomics, metatranscriptomics, metabolomics en metaproteomics zullen ook worden gebruikt om de microbiële diversiteit en functie te bestuderen.

B) Isoleren en karakteriseren van het pathogene potentieel van specifieke microben die geassocieerd zijn met leverziekten: Microbiologische beoordeling van fecale monsters zal ons in staat stellen specifieke microben (bacteriën, virussen en schimmels) op te sommen uit monsters met behulp van conventionele microbiologische kweektechnieken. Deze isolaten zullen vervolgens worden geïdentificeerd en beoordeeld op hun pathogenetisch potentieel. Dit omvat genomische beoordeling van pathogeniteit, waarbij gebruik wordt gemaakt van technieken zoals sequencing van het hele genoom om specifieke eigenschappen te karakteriseren. We zullen ook metabolomische beoordeling van pathogene microben uitvoeren om te zoeken naar veranderingen in de routes die verband houden met het galzout-, alcohol- en korteketenvetzuurmetabolisme. Dit omvat transcriptomische beoordeling van de pathogene stammen, evenals gaschromatografie om de bijproducten van hun metabolisme te bestuderen.

Werkpakket 2: Beoordeling van de reactie van de gastheer op specifieke microben bij leverziekten. Dit werkpakket omvat het verzamelen van 30 ml bloed van patiënten en controles. Deze groep proefpersonen krijgt specifiek toestemming voor bloedonderzoek. Dit bloed zal worden gebruikt om macrofagen te genereren die nodig zullen zijn voor de challenge-studies. Pathogene microben geïdentificeerd in Studie 1 zullen worden beoordeeld op hun pro-inflammatoire potentieel door middel van challenge-experimenten op cellijnen, weefselorganoïden en experimentele diermodellen. Bloed afgenomen op het moment van rekrutering zal worden beoordeeld op tekenen van ontstekingsmediatoren na provocatie met infectieuze agentia geïdentificeerd in onderzoek 1. Volbloed verzameld ~ 30 ml (2 eetlepels) zal worden toegevoegd aan een panel van bacteriële/virale en schimmelcellen en deze zullen maximaal 48 uur worden geïncubeerd. Bewijs van ontstekingsontwikkeling zal worden bestudeerd met behulp van moleculaire technieken, waaronder (maar niet uitsluitend) ELISA en flowcytometrische analyse. Bij een deel van de proefpersonen zal bloed worden afgenomen om perifere bloedmonocytcellen (PBMC's) te extraheren om de systemische immuunrespons tegen deze vermeende pathogenen te beoordelen.

Werkpakket 3: Karakteriseer de veranderingen in de immuunmicro-omgeving van de lever door leverbiopten van patiënten te analyseren. Dit werkpakket zal worden uitgevoerd om de inflammatoire veranderingen op te helderen die in de lever optreden als reactie op de darmpathogenen. Een kleine subgroep van patiënten die om klinische redenen een leverbiopsie ondergaan, zal toestemming krijgen voor een klein deel van het leverweefsel dat groter is dan wat nodig is voor diagnostische doeleinden. Het grootste deel wordt opgestuurd voor pathologisch onderzoek. Dit kleine overtollige deel wordt door de radioloog uit de leverbiopsie afgesneden en direct overgedragen aan een lid van het onderzoeksteam. Dit wordt voor verwerking in een fles met vloeibare stikstof naar het laboratorium van de Universiteit van Aberdeen getransporteerd. Hepatocyten zullen vervolgens uit deze leverbiopsiemonsters worden geïsoleerd voor single-cell RNA-sequencing-analyse (ScRNAseq). Leverweefsel zal ook worden gebruikt om ruimtelijke transcriptomics uit te voeren die het exacte gebied van metabolische verandering zullen lokaliseren.