Vurdering af mikroorganismer og værtsrespons ved leversygdomme (MILD)

Formål og design:

Nøglespørgsmålet for denne forskningsundersøgelse er at belyse tarmmikrobiotaens rolle (bakterier, svampe og vira) i udviklingen og progressionen af ​​leversygdomme. Der er en stor mængde eksisterende litteratur, som tyder på, at der er en ændring i arten af ​​tarmmikroberne ved leversygdomme. Men den specifikke rolle, som 'tarmviromet' spiller i leversygdomme, er stadig et område i vækst. Dets forhold til bakterier og svampe i lumen og interaktion med værtens immunsystem skal karakteriseres ved leversygdomme. Denne undersøgelse har til formål at se på værts-mikrobe-dynamikken i leversygdomme, hvilket ikke kun vil føre til en bedre forståelse af patogenesen af ​​disse sygdomme, men også hjælpe med at designe terapeutiske interventioner for at forhindre progression. Forslaget er blevet peer-reviewet af kolleger på Aberdeen Royal Infirmary. En bredere formidling af resultaterne vil ske gennem publikationer i videnskabelige tidsskrifter og gennem offentlige engagementsfora.

Rekruttering:

Patienter vil blive rekrutteret fra Peter Brunt Gastrointestinal (GI) og leverklinikken og GI- og leverafdelingen på Aberdeen Royal Infirmary. Ambulante deltagere vil få tilsendt deltagerinformationsark med posten før deres kliniske fremmøde sammen med deres klinikaftalebrev, så de har tid nok til at forstå oplysningerne. Ved deres klinikaftale vil de få samtykke fra et medlem af det kliniske team, og et opsamlingssæt udleveres til dem til en fæcesprøve. For patienter med leversygdom, der er i behandling på afdelingen, vil vi indsamle afføringsprøver efter informeret samtykke. Oplysninger om årsagen til og stadiet af leversygdom vil rutinemæssigt blive indsamlet fra disse patienters journaler. Vi vil også gerne indhente fæcesprøver fra en undergruppe af patienter over et længere tidsforløb for at se udviklingen af ​​tarmmikrobiota over tid. Vi vil anmode om yderligere to fæcesprøver over en periode på seks måneder. Alle de nødvendige indsamlingsbeholdere og information til levering af disse prøver til forskningslaboratoriet ved Institute of Medical Sciences, University of Aberdeen vil blive leveret. Endelig kan vi anmode om en blodprøve fra en undergruppe af patienter (n=25) til udfordringsundersøgelser. I alt 30 ml blod vil blive indsamlet fra denne undergruppe af patienter. Disse patienter vil blive givet specifikt samtykke fra det kliniske team.

En meget lille gruppe patienter vil blive identificeret, når de er opført til en leverbiopsi. Denne procedure udføres af diagnostiske årsager eller for at iscenesætte sygdommen i en specifik kohorte af patienter med leversygdom. Beslutningen om at tage biopsien tages af deres konsulterende hepatolog. Biopsien foretages i dagstue på en planlagt måde. Patienterne får tilsendt et aftalebrev om at komme til indgrebet. Informationsbladene om deltagelse vil blive sendt sammen med disse breve for at overveje informationen på forhånd. De vil blive godkendt af et medlem af det kliniske team på dagen for biopsien.

Leverbiopsien udføres af en rådgivende radiolog. En del af levervævet ud over det, der kræves til diagnostiske formål, vil blive afskåret fra hovedprøven. Portionen vil ikke være mere end 0,5 cm med mindst 2 cm levervæv sendt til laboratoriet til klinisk og patologisk vurdering. Den del, der tages til forskning, vil blive opbevaret og transporteret til University of Aberdeen laboratoriet i en flydende nitrogenkolbe til vurdering af arbejdspakke 3. Celler vil derefter blive isoleret fra disse prøver til enkeltcelle-RNA-sekventeringsanalyse (ScRNAseq) analyse. Levervæv vil også blive brugt til at udføre rumlig transkriptomik, som vil lokalisere det nøjagtige område af metabolisk ændring. Disse celler vil også blive brugt til at skabe vævsorganoider.

Der er to leverforskningssygeplejersker og en hepatologisk forskningsstipendiat, som vil hjælpe med at koordinere undersøgelsen. Der er fem rådgivende hepatologer og specialiserede registratorer, som vil hjælpe med at identificere potentielle patienter. Vi forventer indsamling af 200 leversygdomspatienter og et tilsvarende antal passende matchede kontrolpersoner over den femårige foreslåede undersøgelsesperiode for den bredere undersøgelse. Vi ville forvente 50 forsøgspersoner til leverbiopsi-undergruppeundersøgelsen i samme tidsperiode.

Kontrolpersoner vil være raske frivillige rekrutteret fra University of Aberdeen og Aberdeen Royal Infirmary. Undersøgelsen vil blive annonceret gennem pjecer. Kontroldeltagerne vil blive kontaktet af forskerteamet og vil få udleveret deltagelsesinformationsarkene, som sendes via e-mail eller afleveres personligt 24 timer før samtykke indhentes. Dette vil sikre, at de har tid til at læse og forstå forskningsundersøgelsen. Et indledende screeningsmøde vil finde sted, hvor den frivillige vil møde et medlem af forskerholdet. De vil blive bedt om at udfylde et grundlæggende sundhedsspørgeskema med detaljer om alder, vægt og detaljer om eventuelle relevante helbredstilstande og regelmæssig medicin for at sikre, at de opfylder inklusions-/udelukkelseskriterierne for undersøgelsen. Hvis de opfylder inklusionskriterierne, vil de blive bedt om at underskrive en samtykkeerklæring og vil derefter blive formelt rekrutteret til undersøgelsen. De får et undersøgelsesnummer, som til enhver tid vil blive brugt til at holde deres identitet anonym.

En emnelog vil blive vedligeholdt for alle patienter og kontroller rekrutteret i undersøgelsen, som vil blive opbevaret sikkert i et aflåst skab på University of Aberdeen.

Metodik

Undersøgelsen vil blive udført i University of Aberdeen, Institute of Medical Sciences og Rowett Institute forskningslaboratorier. Undersøgelsen har til formål at belyse rollen af ​​tarmmikrobiota og værtsimmunrespons i leversygdom gennem tre arbejdspakker som beskrevet nedenfor:

Arbejdspakke 1: Undersøgelse af ændring af tarmmikrobiota ved leversygdomme

Denne arbejdspakke involverer indsamling af fæcesprøver fra kvalificerede patienter og raske kontroller til følgende vurderinger:

A) For at undersøge ændringen af ​​tarmmikrobiotaen hos patienter med leversygdomme: Molekylære analyser vil kræve DNA- og RNA-ekstraktion fra fæcesprøver indsamlet fra patienter. PCR-baseret vurdering vil blive anvendt ved hjælp af både universelle og også gruppe/arts-rettede tilgange til at studere mikrobiel diversitet. Efter PCR-analyse kan andre analytiske metoder anvendes, herunder (men ikke udelukkende) klonbibliotekskonstruktion og Sanger-sekventering og også sonderingsbaserede tilgange. Omics-baserede tilgange som 16sRNA-gensekventering, metagenomics, metatranscriptomics, metabolomics og metaproteomics vil også blive brugt til at studere mikrobiel diversitet og funktion.

B) Isoler og karakteriser det patogene potentiale af specifikke mikrober, som er forbundet med leversygdomme: Mikrobiologisk vurdering af fæcesprøver vil give os mulighed for at optælle specifikke mikrober (bakterier, vira og svampe) fra prøver ved hjælp af konventionelle mikrobiologiske dyrkningsteknikker. Disse isolater vil derefter blive identificeret og vurderet for deres patogenetiske potentiale. Dette vil involvere genomisk vurdering af patogenicitet ved at anvende teknikker som helgenomsekventering til at karakterisere specifikke egenskaber. Vi vil også udføre metabolomisk vurdering af patogene mikrober for at se efter ændringer i veje vedrørende galdesalt, alkohol og kortkædet fedtsyremetabolisme. Dette vil involvere transkriptomisk vurdering af de patogene stammer samt gaskromatografi for at studere biprodukterne af deres metabolisme.

Arbejdspakke 2: Vurdering af værtsrespons på specifikke mikrober i leversygdomme Denne arbejdspakke vil involvere indsamling af 30 ml blod fra patienter og kontroller. Denne gruppe af forsøgspersoner vil blive givet specifikt samtykke til blodprøvetagning. Dette blod vil blive brugt til at generere makrofager, som vil være nødvendige for udfordringsundersøgelserne. Patogene mikrober identificeret i undersøgelse 1 vil blive vurderet for deres pro-inflammatoriske potentiale gennem udfordringsforsøg på cellelinjer, vævsorganoider og eksperimentelle dyremodeller. Blod taget på rekrutteringstidspunktet vil blive vurderet for tegn på inflammatoriske mediatorer efter infektion med infektiøse agenser identificeret i undersøgelse 1. Fuldblod opsamlet ~ 30 ml (2 spiseskefulde) vil få tilføjet et panel af bakterielle/virale og svampeceller, og disse vil inkuberes i op til 48 timer. Beviser for inflammatorisk udvikling vil blive undersøgt ved hjælp af molekylære teknikker, herunder (men ikke udelukkende) ELISA og flowcytometrisk analyse. I en del af forsøgspersonerne vil der blive taget blod for at udtrække perifere blodmonocytceller (PBMC'er) for at vurdere det systemiske immunrespons mod disse formodede patogener.

Arbejdspakke 3: Karakteriser ændringerne i leverens immunmikromiljø ved at analysere leverbiopsier fra patienter. Denne arbejdspakke vil blive gjort for at belyse de inflammatoriske ændringer, der opstår i leveren som reaktion på tarmpatogenerne. En lille undergruppe af patienter, der af kliniske årsager gennemgår leverbiopsi, vil få samtykke til en lille del af levervævet ud over, hvad der kræves til diagnostiske formål. Den større del vil blive sendt til patologisk vurdering. Denne lille overskydende del vil blive afskåret fra leverbiopsien af ​​radiologen og overdraget straks til et medlem af forskerholdet. Dette vil blive transporteret i en flydende nitrogenkolbe til University of Aberdeen lab til behandling. Hepatocytter vil derefter blive isoleret fra disse leverbiopsiprøver til enkeltcelle-RNA-sekventeringsanalyse (ScRNAseq). Levervæv vil også blive brugt til at udføre rumlig transkriptomik, som vil lokalisere det nøjagtige område af metabolisk ændring.