Оценка микроорганизмов и реакции организма хозяина при заболеваниях печени (MILD)

Назначение и конструкция:

Ключевым вопросом этого исследования является выяснение роли микробиоты кишечника (бактерий, грибов и вирусов) в развитии и прогрессировании заболеваний печени. Существует большое количество литературы, в которой предполагается, что при заболеваниях печени происходит изменение природы кишечных микробов. Однако специфическая роль «кишечного вирома» при заболеваниях печени все еще остается новой областью. Его взаимоотношения с бактериями и грибами в просвете печени и взаимодействие с иммунной системой хозяина необходимо охарактеризовать при заболеваниях печени. Целью данного исследования является изучение динамики взаимодействия между хозяином и микробами при заболеваниях печени, что не только приведет к лучшему пониманию патогенеза этих заболеваний, но и поможет в разработке терапевтических вмешательств для предотвращения прогрессирования. Предложение было рассмотрено коллегами из Королевского госпиталя Абердина. Более широкое распространение результатов будет осуществляться посредством публикаций в научных журналах и на форумах с участием общественности.

Набор персонала:

Пациенты будут набраны из клиники желудочно-кишечного тракта и печени Питера Бранта, а также отделения желудочно-кишечного тракта и печени Королевской больницы Абердина. Перед посещением клиники амбулаторным пациентам будут отправлены информационные листы участников по почте вместе с письмом о записи в клинику, чтобы у них было достаточно времени для понимания информации. На прием в клинике им будет предоставлено согласие члена клинической бригады, и им будет вручен набор для сбора образца фекалий. У пациентов с заболеваниями печени, проходящих лечение в отделении, мы собираем образцы фекалий после получения информированного согласия. Информация о причине и стадии заболевания печени будет регулярно собираться из историй болезни этих пациентов. Мы также хотели бы получить образцы фекалий от подгруппы пациентов в течение длительного периода времени, чтобы увидеть эволюцию микробиоты кишечника с течением времени. Мы запросим еще два образца фекалий в течение шести месяцев. Будут предоставлены все необходимые контейнеры для сбора и информация для доставки этих образцов в исследовательскую лабораторию Института медицинских наук Абердинского университета. Наконец, мы можем запросить образец крови у подгруппы пациентов (n = 25) для проведения контрольных исследований. Всего у этой подгруппы пациентов будет собрано 30 мл крови. Эти пациенты будут получать специальное согласие клинической команды.

Очень небольшая группа пациентов будет выявлена ​​при записи на биопсию печени. Эта процедура проводится в диагностических целях или для определения стадии заболевания у определенной группы пациентов с заболеванием печени. Решение о проведении биопсии принимает консультант-гепатолог. Биопсия проводится в дневном отделении в плановом порядке. Пациентам высылается письмо о записи на процедуру. Информационные листы участия будут отправлены вместе с этими письмами, чтобы рассмотреть информацию заранее. Согласие будет получено от члена клинической бригады в день биопсии.

Биопсия печени проводится консультантом-рентгенологом. От основного образца отрезают часть ткани печени, превышающую необходимую для диагностических целей. Часть не будет превышать 0,5 см, при этом не менее 2 см ткани печени будет отправлено в лабораторию для клинической и патологической оценки. Часть, взятая для исследования, будет храниться и транспортироваться в лабораторию Абердинского университета в колбе с жидким азотом для оценки пакета работ 3. Затем из этих образцов будут выделены клетки для анализа секвенирования одноклеточной РНК (ScRNAseq). Ткань печени также будет использоваться для проведения пространственной транскриптомики, которая позволит локализовать точную область метаболических изменений. Эти клетки также будут использованы для создания тканевых органоидов.

Есть две медсестры, занимающиеся исследованиями печени, и научный сотрудник-гепатолог, которые помогут в координации исследования. В клинике работают пять гепатологов-консультантов и регистраторов-специалистов, которые помогут выявить потенциальных пациентов. Мы ожидаем, что в течение предлагаемого пятилетнего периода исследования будет собрано 200 наборов образцов пациентов с заболеваниями печени и соответствующее количество соответственно подобранных контрольных субъектов для более широкого исследования. Мы ожидаем, что за тот же период времени в подгруппе исследования биопсии печени примут участие 50 субъектов.

Контрольными субъектами будут здоровые добровольцы, набранные из Абердинского университета и Королевской больницы Абердина. Исследование будет рекламироваться посредством брошюр. Исследовательская группа свяжется с участниками контрольной группы и предоставит им информационные листы об участии, которые будут отправлены по электронной почте или переданы лично за 24 часа до получения согласия. Это гарантирует, что у них будет время прочитать и понять исследование. Состоится первоначальная встреча по отбору, во время которой волонтер встретится с членом исследовательской группы. Им будет предложено заполнить базовую анкету о состоянии здоровья с указанием возраста, веса и подробностей о любых соответствующих состояниях здоровья и регулярном приеме лекарств, чтобы убедиться, что они соответствуют критериям включения/исключения для исследования. Если они соответствуют критериям включения, им будет предложено подписать форму согласия, а затем их официально примут в участие в исследовании. Им будет присвоен номер исследования, который будет использоваться в любое время для сохранения анонимности их личности.

Для всех пациентов и контрольной группы, включенных в исследование, будет вестись журнал субъектов, который будет надежно храниться в запертом шкафу в Абердинском университете.

Методология

Исследование будет проводиться в исследовательских лабораториях Абердинского университета, Института медицинских наук и Института Роуэтта. Исследование направлено на выяснение роли микробиоты кишечника и иммунного ответа хозяина при заболеваниях печени с помощью трех пакетов работ, как описано ниже:

Пакет работ 1: Исследование изменения микробиоты кишечника при заболеваниях печени

Этот пакет работ включает в себя сбор образцов фекалий от подходящих пациентов и здоровых представителей контрольной группы для следующих оценок:

А) Изучить изменение микробиоты кишечника у пациентов с заболеваниями печени: Молекулярный анализ потребует выделения ДНК и РНК из образцов фекалий, собранных у пациентов. Для оценки микробного разнообразия на основе ПЦР будут использоваться как универсальные, так и групповые/видовые подходы. После ПЦР-анализа можно использовать другие аналитические методы, включая (но не исключительно) создание библиотеки клонов и секвенирование по Сэнгеру, а также подходы, основанные на зондировании. Подходы, основанные на омике, такие как секвенирование генов 16sRNA, метагеномика, метатранскриптомика, метаболомика и метапротеомика, также будут использоваться для изучения микробного разнообразия и функций.

Б) Изолировать и охарактеризовать патогенный потенциал конкретных микробов, связанных с заболеваниями печени. Микробиологическая оценка образцов фекалий позволит нам подсчитать конкретные микробы (бактерии, вирусы и грибы) из образцов, используя традиционные микробиологические методы культивирования. Затем эти изоляты будут идентифицированы и оценены на предмет их патогенетического потенциала. Это будет включать геномную оценку патогенности с использованием таких методов, как полногеномное секвенирование, для характеристики конкретных признаков. Мы также проведем метаболомическую оценку патогенных микробов, чтобы выявить изменения в путях, связанных с метаболизмом желчных солей, алкоголя и короткоцепочечных жирных кислот. Это будет включать транскриптомную оценку патогенных штаммов, а также газовую хроматографию для изучения побочных продуктов их метаболизма.

Пакет работ 2: Оценка реакции организма на специфические микробы при заболеваниях печени. Этот пакет работ будет включать сбор 30 мл крови у пациентов и контрольной группы. Эта группа субъектов получит специальное согласие на анализ крови. Эта кровь будет использоваться для производства макрофагов, которые понадобятся для исследований. Патогенные микробы, выявленные в исследовании 1, будут оцениваться на предмет их провоспалительного потенциала посредством экспериментов по заражению клеточных линий, тканевых органоидов и экспериментальных моделей животных. Кровь, взятая во время набора, будет оцениваться на наличие медиаторов воспаления после заражения инфекционными агентами, выявленными в исследовании 1. В собранную цельную кровь (около 30 мл (2 столовые ложки)) будет добавлена ​​панель бактериальных/вирусных и грибковых клеток, и они будут инкубировать до 48 часов. Признаки развития воспаления будут изучаться с использованием молекулярных методов, включая (но не исключительно) ELISA и проточный цитометрический анализ. У части пациентов будет взята кровь для извлечения моноцитов периферической крови (МКПК) для оценки системного иммунного ответа против этих предполагаемых патогенов.

Пакет работ 3: Охарактеризовать изменения иммунного микроокружения печени путем анализа биоптатов печени пациентов. Этот комплекс работ будет выполнен для выяснения воспалительных изменений, происходящих в печени в ответ на кишечные патогены. Небольшой подгруппе пациентов, которым проводится биопсия печени по клиническим показаниям, будет разрешено использование небольшого количества ткани печени сверх того, что требуется для диагностических целей. Большую часть отправят на патологоанатомическую экспертизу. Эта небольшая лишняя часть будет отрезана рентгенологом от биопсии печени и немедленно передана члену исследовательской группы. Его перевезут в колбе с жидким азотом в лабораторию Абердинского университета для обработки. Затем из этих образцов биопсии печени будут выделены гепатоциты для анализа секвенирования одноклеточной РНК (ScRNAseq). Ткань печени также будет использоваться для проведения пространственной транскриптомики, которая позволит локализовать точную область метаболических изменений.