Evaluación de microorganismos y respuesta del huésped en enfermedades hepáticas. (MILD)

Objeto y diseño:

La cuestión clave de este estudio de investigación es dilucidar el papel de la microbiota intestinal (bacterias, hongos y virus) en el desarrollo y progresión de la enfermedad hepática. Existe una gran cantidad de literatura que sugiere que existe un cambio en la naturaleza de los microbios intestinales en las enfermedades hepáticas. Sin embargo, el papel específico del "viroma intestinal" en la enfermedad hepática es todavía un campo emergente. En las enfermedades hepáticas es necesario caracterizar su relación con las bacterias y hongos de la luz y la interacción con el sistema inmunológico del huésped. Este estudio tiene como objetivo observar la dinámica huésped-microbio en las enfermedades hepáticas, lo que no solo conducirá a una mejor comprensión de la patogénesis de estas enfermedades sino que también ayudará a diseñar intervenciones terapéuticas para prevenir la progresión. La propuesta ha sido revisada por colegas de Aberdeen Royal Infirmary. Se realizará una difusión más amplia de los resultados a través de publicaciones en revistas científicas y foros de participación pública.

Reclutamiento:

Los pacientes serán reclutados en la clínica Peter Brunt Gastrointestinal (GI) y Hígado, y en la sala gastrointestinal y hepática de Aberdeen Royal Infirmary. A los asistentes ambulatorios se les enviarán por correo hojas de información para participantes antes de su asistencia clínica junto con su carta de cita clínica, para que tengan tiempo suficiente para comprender la información. En su cita clínica, un miembro del equipo clínico les dará el consentimiento y se les entregará un kit de recolección para una muestra fecal. Para los pacientes con enfermedad hepática que reciben tratamiento en la sala, recolectaremos muestras fecales después de obtener el consentimiento informado. La información sobre la causa y el estadio de la enfermedad hepática se recopilará de forma rutinaria de los registros de casos de estos pacientes. También nos gustaría obtener muestras fecales de un subgrupo de pacientes durante un período más prolongado para ver la evolución de la microbiota intestinal a lo largo del tiempo. Solicitaremos dos muestras fecales más durante un período de seis meses. Se proporcionarán todos los contenedores de recolección y la información necesarios para la entrega de estas muestras al laboratorio de investigación del Instituto de Ciencias Médicas de la Universidad de Aberdeen. Finalmente, podemos solicitar una muestra de sangre de un subconjunto de pacientes (n = 25) para estudios de provocación. Se extraerá un total de 30 ml de sangre de este subgrupo de pacientes. Estos pacientes recibirán el consentimiento específico del equipo clínico.

Se identificará un grupo muy pequeño de pacientes cuando se los incluya en la lista para una biopsia de hígado. Este procedimiento se realiza por motivos de diagnóstico o para estadificar la enfermedad en una cohorte específica de pacientes con enfermedad hepática. La decisión de realizar la biopsia la toma su hepatólogo consultor. La biopsia se realiza en una unidad de día de forma planificada. A los pacientes se les envía una carta de cita para asistir al procedimiento. Las hojas informativas de participación se enviarán junto con estas cartas, para considerar la información con antelación. Serán consentidos por un miembro del equipo clínico el día de la biopsia.

La biopsia de hígado la realiza un radiólogo consultor. Se cortará de la muestra principal una porción de tejido hepático superior a la necesaria para fines de diagnóstico. La porción no excederá los 0,5 cm y se enviarán al menos 2 cm de tejido hepático a los laboratorios para evaluación clínica y patológica. La parte tomada para la investigación se guardará y transportará al laboratorio de la Universidad de Aberdeen en un matraz de nitrógeno líquido para la evaluación del paquete de trabajo 3. Luego, las células se aislarán de estas muestras para el análisis de secuenciación de ARN unicelular (ScRNAseq). También se utilizará tejido hepático para realizar transcriptómica espacial que localizará el área exacta de alteración metabólica. Estas células también se utilizarán para crear organoides tisulares.

Hay dos enfermeras de investigación del hígado y un investigador de hepatología que ayudarán a coordinar el estudio. Hay cinco hepatólogos consultores y registradores especializados que ayudarán a identificar posibles pacientes. Anticipamos la recopilación de 200 conjuntos de muestras de pacientes con enfermedad hepática y un número correspondiente de sujetos de control adecuadamente emparejados durante el período de estudio propuesto de cinco años para un estudio más amplio. Anticipamos 50 sujetos para el estudio del subgrupo de biopsia de hígado en el mismo período de tiempo.

Los sujetos de control serán voluntarios sanos reclutados de la Universidad de Aberdeen y Aberdeen Royal Infirmary. El estudio se promocionará mediante folletos. Los participantes de control serán contactados por el equipo de investigación y se les entregarán las hojas de información de participación que serán enviadas por correo electrónico o entregadas personalmente, 24 horas antes de que se obtenga el consentimiento. Esto asegurará que tengan tiempo para leer y comprender el estudio de investigación. Se llevará a cabo una reunión de selección inicial durante la cual el voluntario conocerá a un miembro del equipo de investigación. Se les pedirá que completen un cuestionario de salud básico que detalla la edad, el peso y los detalles de cualquier condición de salud relevante y medicación habitual para garantizar que cumplan con los criterios de inclusión/exclusión del estudio. Si cumplen con los criterios de inclusión, se les pedirá que firmen un formulario de consentimiento y luego serán reclutados formalmente para el estudio. Se les asignará un número de estudio que será utilizado en todo momento para mantener su identidad en el anonimato.

Se mantendrá un registro de sujetos para todos los pacientes y controles reclutados en el estudio que se mantendrá de forma segura en un gabinete cerrado con llave en la Universidad de Aberdeen.

Metodología

El estudio se llevará a cabo en los laboratorios de investigación del Instituto de Ciencias Médicas, el Instituto de Ciencias Médicas y el Instituto Rowett de la Universidad de Aberdeen. El estudio tiene como objetivo dilucidar el papel de la microbiota intestinal y la respuesta inmune del huésped en la enfermedad hepática a través de tres paquetes de trabajo como se describe a continuación:

Paquete de trabajo 1: Investigación de la alteración de la microbiota intestinal en enfermedades hepáticas

Este paquete de trabajo implica la recolección de muestras fecales de pacientes elegibles y controles sanos para las siguientes evaluaciones:

A) Investigar la alteración de la microbiota intestinal en pacientes con enfermedades hepáticas: los análisis moleculares requerirán la extracción de ADN y ARN de muestras fecales recogidas de los pacientes. Se empleará una evaluación basada en PCR utilizando enfoques universales y también dirigidos a grupos/especies para estudiar la diversidad microbiana. Después del análisis por PCR, se pueden emplear otros métodos analíticos que incluyen (pero no exclusivamente) la construcción de bibliotecas de clones y la secuenciación de Sanger y también enfoques basados ​​en sondas. También se utilizarán enfoques basados ​​en ómicas, como la secuenciación del gen 16sRNA, la metagenómica, la metatranscriptómica, la metabolómica y la metaproteómica, para estudiar la diversidad y la función microbiana.

B) Aislar y caracterizar el potencial patógeno de microbios específicos asociados con enfermedades hepáticas: la evaluación microbiológica de muestras fecales nos permitirá enumerar microbios específicos (bacterias, virus y hongos) de muestras utilizando técnicas de cultivo de microbiología convencionales. Estos aislamientos luego serán identificados y evaluados por su potencial patogénico. Esto implicará una evaluación genómica de la patogenicidad utilizando técnicas como la secuenciación del genoma completo para caracterizar rasgos específicos. También realizaremos una evaluación metabolómica de microbios patógenos para buscar alteraciones en las vías relacionadas con el metabolismo de las sales biliares, el alcohol y los ácidos grasos de cadena corta. Esto implicará una evaluación transcriptómica de las cepas patógenas, así como una cromatografía de gases para estudiar los subproductos de su metabolismo.

Paquete de trabajo 2: Evaluación de la respuesta del huésped a microbios específicos en enfermedades hepáticas. Este paquete de trabajo implicará la recolección de 30 ml de sangre de pacientes y controles. Este grupo de sujetos recibirá su consentimiento específico para análisis de sangre. Esta sangre se utilizará para generar macrófagos que serán necesarios para los estudios de provocación. Se evaluará el potencial proinflamatorio de los microbios patógenos identificados en el Estudio 1 mediante experimentos de desafío en líneas celulares, organoides tisulares y modelos animales experimentales. La sangre extraída en el momento del reclutamiento se evaluará en busca de evidencia de mediadores inflamatorios luego de la exposición a agentes infecciosos identificados en el Estudio 1. A la sangre total recolectada ~ 30 ml (2 cucharadas) se les agregará un panel de células bacterianas, virales y fúngicas, y estas incubarse hasta por 48 horas. La evidencia del desarrollo inflamatorio se estudiará utilizando técnicas moleculares que incluyen (pero no exclusivamente) ELISA y análisis de citometría de flujo. En una proporción de sujetos, se extraerá sangre para extraer células de monocitos de sangre periférica (PBMC) para evaluar la respuesta inmune sistémica contra estos supuestos patógenos.

Paquete de trabajo 3: Caracterizar los cambios en el microambiente inmunológico del hígado mediante el análisis de biopsias hepáticas de pacientes. Este paquete de trabajo se realizará para dilucidar los cambios inflamatorios que ocurren dentro del hígado en respuesta a los patógenos intestinales. Un pequeño subgrupo de pacientes a los que se les realiza una biopsia de hígado por motivos clínicos recibirán su consentimiento para una pequeña porción de tejido hepático que excede lo necesario para fines de diagnóstico. La mayor parte será enviada para evaluación patológica. El radiólogo cortará esta pequeña porción sobrante de la biopsia de hígado y la entregará inmediatamente a un miembro del equipo de investigación. Esto se transportará en un matraz de nitrógeno líquido al laboratorio de la Universidad de Aberdeen para su procesamiento. Luego, se aislarán los hepatocitos de estas muestras de biopsia de hígado para el análisis de secuenciación de ARN unicelular (ScRNAseq). También se utilizará tejido hepático para realizar transcriptómica espacial que localizará el área exacta de alteración metabólica.