肝脏疾病中微生物和宿主反应的评估 (MILD)

目的及设计：

这项研究的关键问题是阐明肠道微生物群（细菌、真菌和病毒）在肝病发生和进展中的作用。 大量现有文献表明，肝脏疾病中肠道微生物的性质发生了变化。 然而，“肠道病毒组”在肝病中的具体作用仍然是一个新兴领域。 在肝脏疾病中，需要表征它与管腔中细菌和真菌的关系以及与宿主免疫系统的相互作用。 这项研究旨在研究肝脏疾病中的宿主-微生物动态，这不仅可以更好地了解这些疾病的发病机制，还有助于设计预防进展的治疗干预措施。 该提案已经过阿伯丁皇家医院同事的同行评审。 将通过科学期刊上的出版物和公众参与论坛来更广泛地传播研究结果。

招聘：

患者将从 Peter Brunt 胃肠道 (GI) 和肝脏诊所以及阿伯丁皇家医院的胃肠道和肝脏病房招募。 门诊参加者在就诊前将通过邮寄方式收到参加者信息表以及诊所预约信，以便他们有足够的时间了解信息。 在就诊时，他们将得到临床团队成员的同意，并向他们提供粪便样本收集套件。 对于在病房接受治疗的肝病患者，我们会在获得知情同意后采集粪便样本。 有关肝病病因和阶段的信息将定期从这些患者的病例记录中收集。 我们还希望在较长时间内从一组患者中获取粪便样本，以观察肠道微生物群随时间的演变。 我们将在六个月内再要求提供两份粪便样本。 将提供将这些样本运送到阿伯丁大学医学科学研究所的所有必要的收集容器和信息。 最后，我们可能会要求一部分患者 (n=25) 提供血液样本用于挑战研究。 将从该亚组患者中采集总共 30 毫升的血液。 这些患者将得到临床团队的特别同意。

当极少数患者被列入肝活检名单时，将被识别出来。 该程序是出于诊断原因或对特定肝病患者群体进行疾病分期而进行的。 进行活检的决定由他们的肝病专家顾问做出。 活检是按计划在日间病房进行的。 患者会收到一封预约信来接受手术。 参与信息表将与这些信件一起发送，以便提前考虑这些信息。 活检当天将获得临床团队成员的同意。

肝活检由放射科顾问医师进行。 将从主要样本中切下超出诊断目的所需的部分肝组织。 该部分不超过0.5厘米，其中至少2厘米的肝组织被送往实验室进行临床和病理评估。 用于研究的部分将保存在液氮瓶中并运输到阿伯丁大学实验室，用于工作包 3 评估。 然后将从这些样本中分离出细胞进行单细胞 RNA 测序分析 (ScRNAseq) 分析。 肝脏组织还将用于进行空间转录组学，这将定位代谢改变的确切区域。 这些细胞还将用于创建组织类器官。

有两名肝脏研究护士和一名肝病研究员将帮助协调这项研究。 有五位肝病专家顾问和专业注册员将帮助识别潜在患者。 我们预计在五年的拟议研究期内收集 200 名肝病患者样本集和相应数量的适当匹配的对照受试者，以进行更广泛的研究。 我们预计同一时间段内将有 50 名受试者进行肝活检亚组研究。

对照受试者将是从阿伯丁大学和阿伯丁皇家医院招募的健康志愿者。 该研究将通过小册子进行宣传。 研究团队将联系对照参与者，并在获得同意前 24 小时向对照参与者提供参与信息表，该信息表将通过电子邮件发送或亲自递交。 这将确保他们有时间阅读和理解研究报告。 将举行初步筛选会议，期间志愿者将与研究团队的一名成员会面。 他们将被要求填写一份基本健康调查问卷，详细说明年龄、体重以及任何相关健康状况和常规药物的详细信息，以确保他们符合研究的纳入/排除标准。 如果他们符合纳入标准，那么他们将被要求签署同意书，然后将被正式招募到研究中。 他们将获得一个研究编号，该编号将始终用于保持其身份匿名。

将为研究中招募的所有患者和对照保留受试者日志，并将其安全地保存在阿伯丁大学的上锁柜子中。

方法

该研究将在阿伯丁大学医学科学研究所和罗威特研究所的研究实验室进行。 该研究旨在通过以下三个工作包阐明肠道微生物群和宿主免疫反应在肝脏疾病中的作用：

工作包 1：肝脏疾病中肠道微生物群变化的研究

该工作包包括从符合条件的患者和健康对照中收集粪便样本，以进行以下评估：

A) 研究肝病患者肠道微生物群的变化：分子分析需要从患者粪便样本中提取 DNA 和 RNA。 将采用基于 PCR 的评估，使用通用方法和群体/物种定向方法来研究微生物多样性。 PCR 分析后，可以采用其他分析方法，包括（但不限于）克隆文库构建和桑格测序以及基于探测的方法。 16sRNA 基因测序、宏基因组学、宏转录组学、代谢组学和宏蛋白质组学等基于组学的方法也将用于研究微生物多样性和功能。

B) 分离和表征与肝病相关的特定微生物的致病潜力：粪便样本的微生物评估将使我们能够使用传统微生物培养技术从样本中枚举特定微生物（细菌、病毒和真菌）。 然后将鉴定这些分离株并评估其致病潜力。 这将涉及利用全基因组测序等技术对致病性进行基因组评估来表征特定性状。 我们还将对病原微生物进行代谢组学评估，以寻找与胆汁盐、酒精和短链脂肪酸代谢有关的途径的改变。 这将涉及致病菌株的转录组学评估以及气相色谱法来研究其代谢副产物。

工作包 2：评估宿主对肝脏疾病中特定微生物的反应 该工作包将包括从患者和对照中收集 30 毫升血液。 这组受试者将专门同意进行血液检测。 该血液将用于生成挑战研究所需的巨噬细胞。 研究 1 中确定的致病微生物将通过细胞系、组织类器官和实验动物模型的激发实验来评估其促炎潜力。 在用研究 1 中确定的传染原进行攻击后，将评估招募时采集的血液是否存在炎症介质的证据。收集的全血约 30 毫升（2 汤匙）将添加一组细菌/病毒和真菌细胞，这些细胞将孵育长达 48 小时。 将使用分子技术来研究炎症发展的证据，包括（但不限于）ELISA 和流式细胞术分析。 在一部分受试者中，将抽取血液来提取外周血单核细胞 (PBMC)，以评估针对这些假定病原体的全身免疫反应。

工作包 3：通过分析患者的肝活检来表征肝脏免疫微环境的变化。 该工作包将旨在阐明肝脏内因肠道病原体而发生的炎症变化。 出于临床原因接受肝活检的一小部分患者将同意获取超出诊断目的所需的一小部分肝组织。 较大的部分将被送去进行病理评估。 放射科医生将从肝脏活检中切下这一小部分多余部分，并立即交给研究小组的成员。 这将被装在液氮烧瓶中运送到阿伯丁大学实验室进行处理。 然后将从这些肝脏活检样本中分离出肝细胞进行单细胞 RNA 测序分析 (ScRNAseq)。 肝脏组织还将用于进行空间转录组学，这将定位代谢改变的确切区域。