Valutazione dei microrganismi e risposta dell'ospite nelle malattie del fegato (MILD)

Scopo e progettazione:

La questione chiave di questo studio di ricerca è chiarire il ruolo del microbiota intestinale (batteri, funghi e virus) nello sviluppo e nella progressione della malattia epatica. Esiste un’ampia letteratura che suggerisce che vi sia un cambiamento nella natura dei microbi intestinali nelle malattie del fegato. Tuttavia, il ruolo specifico del “viroma intestinale” nelle malattie del fegato è ancora un campo emergente. Nelle malattie del fegato è necessario caratterizzare la sua relazione con i batteri e i funghi nel lume e l'interazione con il sistema immunitario ospite. Questo studio mira a esaminare la dinamica del microbiota ospite nelle malattie del fegato, che non solo porterà a una migliore comprensione della patogenesi di queste malattie, ma aiuterà anche a progettare interventi terapeutici per prevenirne la progressione. La proposta è stata sottoposta a revisione paritaria da parte dei colleghi dell’Aberdeen Royal Infirmary. Una più ampia diffusione dei risultati avverrà attraverso pubblicazioni su riviste scientifiche e forum di coinvolgimento pubblico.

Reclutamento:

I pazienti verranno reclutati dalla clinica gastrointestinale e epatica Peter Brunt e dal reparto gastrointestinale ed epatico dell'Aberdeen Royal Infirmary. Ai partecipanti ambulatoriali verranno inviate per posta le schede informative dei partecipanti prima della frequenza clinica insieme alla lettera di appuntamento in clinica, in modo che abbiano abbastanza tempo per comprendere le informazioni. All'appuntamento in clinica, riceveranno il consenso da un membro del team clinico e riceveranno loro un kit di raccolta per un campione fecale. Per i pazienti con malattia epatica in cura in reparto, raccoglieremo campioni fecali dopo aver ottenuto il consenso informato. Le informazioni riguardanti la causa e lo stadio della malattia epatica verranno regolarmente raccolte dalle cartelle cliniche di questi pazienti. Vorremmo anche ottenere campioni fecali da un sottogruppo di pazienti in un periodo di tempo più lungo per vedere l’evoluzione del microbiota intestinale nel tempo. Richiederemo altri due campioni fecali nell'arco di sei mesi. Verranno forniti tutti i contenitori di raccolta necessari e le informazioni per la consegna di questi campioni al laboratorio di ricerca dell'Istituto di scienze mediche dell'Università di Aberdeen. Infine, potremmo richiedere un campione di sangue da un sottogruppo di pazienti (n = 25) per studi di provocazione. Da questo sottogruppo di pazienti verranno raccolti un totale di 30 ml di sangue. Questi pazienti saranno autorizzati specificatamente dal team clinico.

Un gruppo molto piccolo di pazienti verrà identificato quando verranno elencati per una biopsia epatica. Questa procedura viene eseguita per ragioni diagnostiche o per stadiare la malattia in una coorte specifica di pazienti con malattia epatica. La decisione di eseguire la biopsia viene presa dal loro epatologo consulente. La biopsia viene eseguita in un day-case unit in modo pianificato. Ai pazienti viene inviata una lettera di appuntamento per presentarsi alla procedura. Insieme a queste lettere verranno inviate le schede informative per la partecipazione, per valutare preventivamente le informazioni. Saranno acconsentiti da un membro dell'équipe clinica il giorno della biopsia.

La biopsia epatica viene eseguita da un radiologo consulente. Dal campione principale verrà eliminata una porzione di tessuto epatico eccedente quella necessaria ai fini diagnostici. La porzione non sarà superiore a 0,5 cm con almeno 2 cm di tessuto epatico inviato ai laboratori per la valutazione clinica e patologica. La porzione prelevata per la ricerca verrà conservata e trasportata al laboratorio dell'Università di Aberdeen in un pallone di azoto liquido per la valutazione del pacchetto di lavoro 3. Le cellule verranno quindi isolate da questi campioni per l'analisi di sequenziamento dell'RNA di singole cellule (ScRNAseq). Il tessuto epatico verrà utilizzato anche per eseguire la trascrittomica spaziale che localizzerà l'esatta area dell'alterazione metabolica. Queste cellule verranno utilizzate anche per creare organoidi tissutali.

Ci sono due infermieri ricercatori sul fegato e un ricercatore di epatologia che aiuteranno a coordinare lo studio. Ci sono cinque epatologi consulenti e registrar specialisti che aiuteranno a identificare i potenziali pazienti. Anticiperemmo la raccolta di 200 set di campioni di pazienti con malattie epatiche e un numero corrispondente di soggetti di controllo opportunamente abbinati durante il periodo di studio proposto di cinque anni per lo studio più ampio. Nello stesso periodo di tempo prevediamo 50 soggetti per il sottogruppo di studio sulla biopsia epatica.

I soggetti di controllo saranno volontari sani reclutati dall'Università di Aberdeen e dall'Aberdeen Royal Infirmary. Lo studio verrà pubblicizzato tramite opuscoli. I partecipanti al controllo verranno contattati dal gruppo di ricerca e riceveranno le schede informative sulla partecipazione che verranno inviate via email o consegnate di persona, 24 ore prima dell'ottenimento del consenso. Ciò garantirà che abbiano il tempo di leggere e comprendere lo studio di ricerca. Si svolgerà un primo incontro di screening durante il quale il volontario incontrerà un membro del gruppo di ricerca. Verrà chiesto loro di completare un questionario sanitario di base che dettaglia età, peso e dettagli di eventuali condizioni di salute rilevanti e farmaci regolari per garantire che soddisfino i criteri di inclusione/esclusione per lo studio. Se soddisfano i criteri di inclusione, verrà chiesto loro di firmare un modulo di consenso e verranno quindi reclutati formalmente nello studio. Verrà loro assegnato un numero di studio che verrà utilizzato in ogni momento per mantenere anonima la loro identità.

Verrà mantenuto un registro dei soggetti per tutti i pazienti e i controlli reclutati nello studio che sarà conservato in modo sicuro in un armadietto chiuso a chiave presso l'Università di Aberdeen.

Metodologia

Lo studio sarà condotto nei laboratori di ricerca dell’Università di Aberdeen, dell’Institute of Medical Sciences e del Rowett Institute. Lo studio mira a chiarire il ruolo del microbiota intestinale e della risposta immunitaria dell’ospite nelle malattie epatiche attraverso tre pacchetti di lavoro come descritto di seguito:

Pacchetto di lavoro 1: Studio dell'alterazione del microbiota intestinale nelle malattie del fegato

Questo pacchetto di lavoro prevede la raccolta di campioni fecali da pazienti idonei e controlli sani per le seguenti valutazioni:

A) Studiare l'alterazione del microbiota intestinale nei pazienti con malattie epatiche: le analisi molecolari richiederanno l'estrazione di DNA e RNA da campioni fecali raccolti dai pazienti. La valutazione basata sulla PCR sarà impiegata utilizzando approcci sia universali che diretti a gruppi/specie per studiare la diversità microbica. Dopo l'analisi PCR, possono essere impiegati altri metodi analitici tra cui (ma non esclusivamente) la costruzione di librerie di cloni e il sequenziamento di Sanger e anche approcci basati sul sondaggio. Per studiare la diversità e la funzione microbica verranno utilizzati anche approcci basati sulle omiche, come il sequenziamento del gene 16sRNA, la metagenomica, la metatrascrittomica, la metabolomica e la metaproteomica.

B) Isolare e caratterizzare il potenziale patogeno di microbi specifici associati a malattie del fegato: la valutazione microbiologica dei campioni fecali ci consentirà di enumerare microbi specifici (batteri, virus e funghi) da campioni utilizzando tecniche di coltura microbiologica convenzionali. Questi isolati verranno poi identificati e valutati per il loro potenziale patogenetico. Ciò comporterà la valutazione genomica della patogenicità utilizzando tecniche come il sequenziamento dell'intero genoma per caratterizzare tratti specifici. Effettueremo anche una valutazione metabolomica dei microbi patogeni per cercare alterazioni nei percorsi relativi al metabolismo dei sali biliari, dell'alcol e degli acidi grassi a catena corta. Ciò comporterà la valutazione trascrittomica dei ceppi patogeni e la gascromatografia per studiare i sottoprodotti del loro metabolismo.

Pacchetto di lavoro 2: Valutazione della risposta dell'ospite a microbi specifici nelle malattie del fegato Questo pacchetto di lavoro comporterà la raccolta di 30 ml di sangue da pazienti e controlli. Questo gruppo di soggetti sarà acconsentito specificatamente per gli esami del sangue. Questo sangue verrà utilizzato per generare macrofagi che saranno necessari per gli studi di sfida. I microbi patogeni identificati nello Studio 1 saranno valutati per il loro potenziale pro-infiammatorio attraverso esperimenti di sfida su linee cellulari, organoidi tissutali e modelli animali sperimentali. Il sangue prelevato al momento del reclutamento sarà valutato per l'evidenza di mediatori infiammatori in seguito all'esposizione ad agenti infettivi identificati nello Studio 1. Al sangue intero raccolto ~ 30 ml (2 cucchiai) verrà aggiunto un pannello di cellule batteriche/virali e fungine che verranno essere incubato per un massimo di 48 ore. L'evidenza dello sviluppo infiammatorio sarà studiata utilizzando tecniche molecolari tra cui (ma non esclusivamente) ELISA e analisi citofluorimetrica. In una parte dei soggetti, verrà prelevato sangue per estrarre le cellule monociti del sangue periferico (PBMC) per valutare la risposta immunitaria sistemica contro questi presunti patogeni.

Pacchetto di lavoro 3: Caratterizzare i cambiamenti nel microambiente immunitario del fegato analizzando le biopsie epatiche dei pazienti. Questo pacchetto di lavoro verrà svolto per chiarire i cambiamenti infiammatori che si verificano nel fegato in risposta agli agenti patogeni intestinali. Un piccolo sottogruppo di pazienti sottoposti a biopsia epatica per ragioni cliniche sarà autorizzato a prelevare una piccola porzione di tessuto epatico in eccesso rispetto a quanto richiesto a fini diagnostici. La porzione più grande verrà inviata per la valutazione patologica. Questa piccola porzione in eccesso verrà prelevata dal radiologo dalla biopsia epatica e consegnata immediatamente a un membro del gruppo di ricerca. Questo verrà trasportato in un pallone di azoto liquido al laboratorio dell'Università di Aberdeen per l'elaborazione. Gli epatociti verranno quindi isolati da questi campioni di biopsia epatica per l'analisi di sequenziamento dell'RNA a cellula singola (ScRNAseq). Il tessuto epatico verrà utilizzato anche per eseguire la trascrittomica spaziale che localizzerà l'esatta area di alterazione metabolica.