A mikroorganizmusok és a gazdaszervezet válaszreakciójának felmérése májbetegségekben (MILD)

Cél és kialakítás:

A kutatás kulcskérdése a bélmikrobióta (baktériumok, gombák és vírusok) szerepének tisztázása a májbetegség kialakulásában és progressziójában. A meglévő irodalom nagy mennyiségben azt sugallja, hogy a bélmikrobák természete megváltozik májbetegségekben. A „bél viróma” májbetegségben betöltött sajátos szerepe azonban még mindig csak kialakulóban van. Májbetegségekben jellemezni kell a lumenben lévő baktériumokkal és gombákkal való kapcsolatát, valamint a gazdaszervezet immunrendszerével való interakcióját. A tanulmány célja, hogy megvizsgálja a gazda-mikroba dinamikáját a májbetegségekben, ami nemcsak e betegségek patogenezisének jobb megértéséhez vezet, hanem segít a progresszió megelőzésére szolgáló terápiás beavatkozások megtervezésében is. A javaslatot az Aberdeen Royal Infirmary munkatársai felülvizsgálták. Az eredmények szélesebb körű terjesztésére tudományos folyóiratokban publikálásokon és nyilvános részvételi fórumokon keresztül kerül sor.

Toborzás:

A betegeket a Peter Brunt Gastrointestinalis (GI) és Májklinikáról, valamint az Aberdeen Royal Infirmary GI és máj osztályáról veszik fel. A járóbeteg-ellátásban részt vevők számára a klinikai látogatás előtt levélben elküldik a résztvevői tájékoztatót a klinikai időpontra vonatkozó levelükkel együtt, hogy elegendő idejük legyen az információk megértésére. Klinikai találkozójukon a klinikai csoport egyik tagja beleegyezik, és egy gyűjtőkészletet ad át nekik a székletmintához. Az osztályon kezelt májbetegségben szenvedő betegektől a beleegyezés megszerzése után székletmintát veszünk. A májbetegség okára és stádiumára vonatkozó információkat rutinszerűen gyűjtik ezen betegek esetnyilvántartásából. Szeretnénk a betegek egy alcsoportjától székletmintákat is szerezni hosszabb időn keresztül, hogy lássuk a bélmikrobióta időbeli alakulását. Hat hónapon belül további két székletmintát fogunk kérni. A mintáknak az Aberdeeni Egyetem Orvostudományi Intézetének kutatólaboratóriumába történő eljuttatásához szükséges összes gyűjtőedényt és információt biztosítanak. Végül kérhetünk vérmintát a betegek egy részhalmazától (n=25) a provokációs vizsgálatokhoz. A betegek ebből az alcsoportjából összesen 30 ml vért vesznek le. Ezeket a betegeket a klinikai csapat kifejezetten jóváhagyja.

A betegek nagyon kis csoportját azonosítják, amikor felveszik őket májbiopsziára. Ezt az eljárást diagnosztikai okokból vagy a betegség meghatározott májbetegségben szenvedő betegek csoportjában történő szakaszosítása céljából végzik. A biopszia elvégzéséről a hepatológus szakorvos dönt. A biopsziát napi egységgel, tervezett módon végzik. A betegeknek időpont-egyeztetési levelet küldenek, hogy bejöjjenek a beavatkozásra. Ezekkel a levelekkel együtt elküldjük a részvételi tájékoztatót, hogy előzetesen mérlegeljük a tájékoztatást. A biopszia napján a klinikai csoport egy tagja beleegyezik.

A májbiopsziát radiológus szaktanácsadó végzi. A májszövetnek a diagnosztikai célokra szükségesnél nagyobb részét levágják a főmintából. A rész nem lehet nagyobb 0,5 cm-nél, és legalább 2 cm-es májszövetet kell elküldeni a laboratóriumba klinikai és patológiai értékelésre. A kutatásra vett részt egy folyékony nitrogénes lombikban tartják és szállítják az Aberdeeni Egyetem laborjába a 3. munkacsomag értékeléséhez. Ezután a sejteket izoláljuk ezekből a mintákból egysejtű RNS szekvenálási analízis (ScRNAseq) analízishez. A májszövetet térbeli transzkriptomika végrehajtására is felhasználják, amely meghatározza a metabolikus változás pontos területét. Ezeket a sejteket szöveti organoidok létrehozására is használják majd.

Két májkutató nővér és egy hepatológiai kutató segít a vizsgálat koordinálásában. Öt konzultáns hepatológus és szakregiszter van, akik segítenek a leendő betegek azonosításában. A szélesebb körű vizsgálathoz javasolt ötéves vizsgálati időszak alatt 200 májbetegségben szenvedő beteg mintakészletének és megfelelő számú, megfelelően illeszkedő kontrollalanynak a gyűjtésére számítunk. A májbiopsziás alcsoportos vizsgálatban 50 alanyra számítunk ugyanebben az időszakban.

A kontroll alanyok egészséges önkéntesek, akiket az Aberdeeni Egyetemről és az Aberdeeni Királyi Kórházról toboroztak. A tanulmányt brosúrákon keresztül hirdetjük meg. A kontroll résztvevőkkel a kutatócsoport felveszi a kapcsolatot, és megkapják a részvételi tájékoztatót, amelyet e-mailben küldenek el vagy személyesen adnak át, 24 órával a hozzájárulás megszerzése előtt. Ez biztosítja, hogy legyen idejük elolvasni és megérteni a kutatási tanulmányt. Egy kezdeti szűrési találkozóra kerül sor, amely során az önkéntes találkozik a kutatócsoport egy tagjával. Felkérik őket, hogy töltsenek ki egy alapvető egészségügyi kérdőívet, amely részletezi az életkort, a testsúlyt és a vonatkozó egészségügyi állapotok részleteit, valamint a rendszeres gyógyszeres kezelést annak biztosítása érdekében, hogy megfeleljenek a vizsgálatba való felvételi/kizárási kritériumoknak. Ha megfelelnek a felvételi kritériumoknak, akkor felkérik őket, hogy írjanak alá egy beleegyezési űrlapot, majd hivatalosan bevonják őket a vizsgálatba. Tanulmányi számot kapnak, amelyet mindenkor használnak, hogy névtelenül őrzzék személyazonosságukat.

A vizsgálatba bevont összes betegről és kontrollcsoportról alanyi naplót vezetnek, amelyet biztonságosan az Aberdeeni Egyetem zárt szekrényében fognak tartani.

Módszertan

A vizsgálatot az Aberdeeni Egyetem Orvostudományi Intézetében és a Rowett Institute kutatólaboratóriumában végzik. A tanulmány célja a bélmikrobióta és a gazdaszervezet immunválaszának májbetegségben betöltött szerepének tisztázása az alábbiakban ismertetett három munkacsomagon keresztül:

1. munkacsomag: A bélmikrobióta változásának vizsgálata májbetegségekben

Ez a munkacsomag székletmintákat gyűjt a jogosult betegektől és egészséges kontrollokat a következő értékelésekhez:

A) A bélmikrobióta változásának vizsgálata májbetegségben szenvedő betegeknél: A molekuláris analízishez DNS és RNS extrakcióra lesz szükség a betegektől gyűjtött székletmintákból. A PCR alapú értékelést mind univerzális, mind csoport/fajspecifikus megközelítések alkalmazásával fogják alkalmazni a mikrobiális diverzitás tanulmányozására. A PCR-elemzést követően más analitikai módszerek is alkalmazhatók, beleértve (de nem kizárólagosan) a klónkönyvtár-építést és a Sanger-szekvenálást, valamint a szondázáson alapuló megközelítéseket. Omikán alapuló megközelítéseket, mint például a 16sRNS génszekvenálás, a metagenomika, a metatranszkriptomika, a metabolomika és a metaproteomika is alkalmazni fogják a mikrobiális sokféleség és funkció tanulmányozására.

B) Különleges, májbetegségekkel összefüggő mikrobák kórokozó-potenciáljának izolálása és jellemzése: A székletminták mikrobiológiai vizsgálata lehetővé teszi, hogy a mintákból specifikus mikrobákat (baktériumok, vírusok és gombák) soroljunk fel a hagyományos mikrobiológiai tenyésztési technikák segítségével. Ezeket az izolátumokat ezután azonosítják és patogenetikai potenciáljukat értékelik. Ez magában foglalja a patogenitás genomikai értékelését olyan technikák felhasználásával, mint a teljes genom szekvenálása a specifikus tulajdonságok jellemzésére. A kórokozó mikrobák metabolomikus vizsgálatát is elvégezzük, hogy az epesó-, alkohol- és rövid szénláncú zsírsav-anyagcseréhez kapcsolódó útvonalak változását keressük. Ez magában foglalja a patogén törzsek transzkriptomikus értékelését, valamint gázkromatográfiát, hogy tanulmányozzák metabolizmusuk melléktermékeit.

2. munkacsomag: A gazdaszervezet specifikus mikrobákra adott válaszának értékelése májbetegségekben Ez a munkacsomag 30 ml vér gyűjtését foglalja magában a betegektől és a kontrollcsoportoktól. Az alanyok ezen csoportja kifejezetten vérvizsgálatra lesz jóváhagyva. Ezt a vért makrofágok előállítására fogják használni, amelyekre szükség lesz a provokációs vizsgálatokhoz. Az 1. vizsgálatban azonosított patogén mikrobák gyulladáskeltő potenciálját sejtvonalakon, szöveti organoidokon és kísérleti állatmodelleken végzett provokációs kísérletekkel fogják értékelni. A toborzáskor vett vért az 1. vizsgálatban azonosított fertőző ágensekkel való fertőzést követően értékelik a gyulladásos mediátorok jelenlétére. A kb. 30 ml-es (2 evőkanál) teljes vérből bakteriális/vírusos és gombasejteket adunk hozzá, és ezek legfeljebb 48 óráig kell inkubálni. A gyulladásos fejlődés bizonyítékait molekuláris technikákkal, köztük (de nem kizárólagosan) ELISA-val és áramlási citometriás analízissel vizsgálják. Az alanyok egy részéből vért vesznek a perifériás vér monocita sejtek (PBMC) kivonására, hogy felmérjék a szisztémás immunválaszt ezekkel a feltételezett kórokozókkal szemben.

3. munkacsomag: A máj immunmikrokörnyezetében bekövetkezett változások jellemzése a betegek májbiopsziáinak elemzésével. Ezt a munkacsomagot a bélrendszer kórokozóira adott válaszként a májban fellépő gyulladásos változások tisztázása érdekében végzik. A klinikai okokból májbiopszián átesett betegek egy kis alcsoportja a diagnosztikai célokra szükségesnél nagyobb mennyiségű májszövetet kap. A nagyobb részt patológiai vizsgálatra küldik el. Ezt a kis felesleges részt a radiológus levágja a májbiopsziáról, és azonnal átadja a kutatócsoport egyik tagjának. Ezt egy folyékony nitrogénes lombikban szállítják az Aberdeeni Egyetem laborjába feldolgozásra. Ezekből a májbiopsziás mintákból ezután hepatocitákat izolálnak az egysejtű RNS szekvenálási analízishez (ScRNAseq). A májszövetet térbeli transzkriptomika végrehajtására is felhasználják, amely meghatározza a metabolikus változás pontos területét.