Bedömning av mikroorganismer och värdrespons vid leversjukdomar (MILD)

Syfte och design:

Nyckelfrågan i denna forskningsstudie är att belysa tarmmikrobiotans roll (bakterier, svampar och virus) i utvecklingen och progressionen av leversjukdom. Det finns en stor mängd befintlig litteratur som tyder på att det finns en förändring i arten av tarmmikrober vid leversjukdomar. Men den specifika roll som "tarmvirom" spelar vid leversjukdom är fortfarande ett framväxande område. Dess förhållande till bakterierna och svamparna i lumen och interaktionen med värdens immunsystem måste karakteriseras vid leversjukdomar. Denna studie syftar till att titta på värd-mikrob-dynamiken i leversjukdomar, vilket inte bara kommer att leda till en bättre förståelse av patogenesen av dessa sjukdomar utan också hjälpa till att utforma terapeutiska interventioner för att förhindra progression. Förslaget har granskats av kollegor på Aberdeen Royal Infirmary. En bredare spridning av resultaten kommer att ske genom publikationer i vetenskapliga tidskrifter och genom offentliga engagemangsforum.

Rekrytering:

Patienter kommer att rekryteras från Peter Brunt Gastrointestinal (GI) och leverklinik, och GI- och leveravdelningen vid Aberdeen Royal Infirmary. Öppenvårdsdeltagare kommer att skickas deltagarinformationsblad via post innan deras kliniska närvaro tillsammans med deras klinikbokningsbrev, för att de ska ha tillräckligt med tid att förstå informationen. Vid deras klinikbesök kommer de att godkännas av en medlem av det kliniska teamet och ett uppsamlingspaket överlämnas till dem för ett avföringsprov. För patienter med leversjukdom som behandlas på avdelningen tar vi avföringsprov efter informerat samtycke. Information om orsaken och stadiet av leversjukdom kommer rutinmässigt att samlas in från dessa patienters fallregister. Vi skulle också vilja erhålla fekala prover från en undergrupp av patienter över ett längre tidsförlopp för att se utvecklingen av tarmmikrobiota över tiden. Vi kommer att begära ytterligare två fekala prover under en period på sex månader. Alla nödvändiga insamlingsbehållare och information för leverans av dessa prover till forskningslaboratoriet vid Institute of Medical Sciences, University of Aberdeen kommer att tillhandahållas. Slutligen kan vi begära ett blodprov från en undergrupp av patienter (n=25) för utmaningsstudier. Totalt 30 ml blod kommer att samlas in från denna undergrupp av patienter. Dessa patienter kommer att godkännas specifikt av det kliniska teamet.

En mycket liten grupp patienter kommer att identifieras när de listas för en leverbiopsi. Denna procedur görs av diagnostiska skäl eller för att iscensätta sjukdomen i en specifik kohort av patienter med leversjukdom. Beslutet att göra biopsi tas av deras konsulterande hepatolog. Biopsi görs på en dagmottagning på ett planerat sätt. Patienterna får ett mötesbrev för att komma in för ingreppet. Informationsbladen för deltagande kommer att skickas tillsammans med dessa brev, för att överväga informationen i förväg. De kommer att godkännas av en medlem av det kliniska teamet på dagen för biopsi.

Leverbiopsi utförs av en konsulterande radiolog. En del av levervävnaden utöver vad som krävs för diagnostiska ändamål kommer att skäras av från huvudprovet. Portionen kommer inte att vara mer än 0,5 cm med minst 2 cm levervävnad som skickas till labbet för klinisk och patologisk bedömning. Den del som tas för forskning kommer att förvaras och transporteras till University of Aberdeen lab i en flytande kvävekolv för bedömning av arbetspaket 3. Celler kommer sedan att isoleras från dessa prover för encellig RNA-sekvensanalys (ScRNAseq) analys. Levervävnad kommer också att användas för att utföra rumslig transkriptomi som kommer att lokalisera det exakta området för metabolisk förändring. Dessa celler kommer också att användas för att skapa vävnadsorganoider.

Det finns två leverforskarsköterskor och en Hepatologiforskare som kommer att hjälpa till med att koordinera studien. Det finns fem konsulterande hepatologer och specialistregistratorer som hjälper till med att identifiera blivande patienter. Vi skulle förutse insamling av 200 provuppsättningar för leversjukdomspatienter och ett motsvarande antal lämpligt matchade kontrollpersoner under den femåriga föreslagna studieperioden för den bredare studien. Vi skulle förutse 50 försökspersoner för leverbiopsisubgruppsstudien under samma tidsperiod.

Kontrollpersoner kommer att vara friska frivilliga rekryterade från University of Aberdeen och Aberdeen Royal Infirmary. Studien kommer att annonseras genom pamfletter. Kontrolldeltagarna kommer att kontaktas av forskargruppen och kommer att få deltagandeinformationsblad som skickas via e-post eller överlämnas personligen, 24 timmar innan samtycke erhålls. Detta kommer att säkerställa att de har tid att läsa och förstå forskningsstudien. Ett första screeningsmöte kommer att äga rum där volontären träffar en medlem av forskargruppen. De kommer att bli ombedda att fylla i ett grundläggande hälsofrågeformulär som beskriver ålder, vikt och detaljer om eventuella relevanta hälsotillstånd och regelbunden medicinering för att säkerställa att de uppfyller inklusions-/exkluderingskriterierna för studien. Om de uppfyller inklusionskriterierna kommer de att bli ombedda att underteckna ett samtyckesformulär och kommer sedan att formellt rekryteras till studien. De kommer att få ett studienummer som alltid kommer att användas för att hålla sin identitet anonym.

En ämneslogg kommer att föras för alla patienter och kontroller som rekryterats i studien som kommer att förvaras säkert i ett låst skåp på University of Aberdeen.

Metodik

Studien kommer att genomföras i University of Aberdeen, Institute of Medical Sciences och Rowett Institutes forskningslaboratorier. Studien syftar till att klargöra rollen av tarmmikrobiotan och värdimmunsvaret vid leversjukdom genom tre arbetspaket som beskrivs nedan:

Arbetspaket 1: Undersökning av förändringen av tarmmikrobiota vid leversjukdomar

Detta arbetspaket innefattar insamling av avföringsprover från berättigade patienter och friska kontroller för följande bedömningar:

A) För att undersöka förändringen av tarmmikrobiotan hos patienter med leversjukdomar: Molekylära analyser kommer att kräva DNA- och RNA-extraktion från fekala prover från patienter. PCR-baserad bedömning kommer att användas med både universella och även grupp-/artsriktade metoder för att studera mikrobiell mångfald. Efter PCR-analys kan andra analytiska metoder användas inklusive (men inte uteslutande) klonbibliotekskonstruktion och Sanger-sekvensering och även sonderingsbaserade tillvägagångssätt. Omics-baserade metoder som 16sRNA-gensekvensering, metagenomik, metatranskriptomik, metabolomik och metaproteomik kommer också att användas för att studera mikrobiell mångfald och funktion.

B) Isolera och karakterisera den patogena potentialen hos specifika mikrober som är associerade med leversjukdomar: Mikrobiologisk bedömning av fekala prover gör det möjligt för oss att räkna upp specifika mikrober (bakterier, virus och svampar) från prover med hjälp av konventionella mikrobiologiska odlingstekniker. Dessa isolat kommer sedan att identifieras och utvärderas med avseende på deras patogenetiska potential. Detta kommer att involvera genomisk bedömning av patogenicitet med användning av tekniker som helgenomsekvensering för att karakterisera specifika egenskaper. Vi kommer också att utföra metabolomisk bedömning av patogena mikrober för att leta efter förändringar i vägar som hänför sig till gallsalt, alkohol och kortkedjig fettsyrametabolism. Detta kommer att involvera transkriptomisk bedömning av de patogena stammarna samt gaskromatografi för att studera biprodukterna av deras metabolism.

Arbetspaket 2: Bedömning av värdens svar på specifika mikrober i leversjukdomar Detta arbetspaket kommer att involvera insamling av 30 ml blod från patienter och kontroller. Denna grupp av försökspersoner kommer att godkännas specifikt för blodprov. Detta blod kommer att användas för att generera makrofager som kommer att behövas för utmaningsstudierna. Patogena mikrober identifierade i studie 1 kommer att bedömas för sin pro-inflammatoriska potential genom utmaningsexperiment på cellinjer, vävnadsorganoider och experimentella djurmodeller. Blod som tas vid tidpunkten för rekryteringen kommer att bedömas med avseende på tecken på inflammatoriska mediatorer efter provokation med infektionsämnen som identifierats i studie 1. Helblod som samlas in ~ 30 ml (2 matskedar) kommer att ha en panel av bakteriella/virala och svampceller tillsatta och dessa kommer att inkuberas i upp till 48 timmar. Bevis på inflammatorisk utveckling kommer att studeras med hjälp av molekylära tekniker inklusive (men inte uteslutande) ELISA och flödescytometrisk analys. I en del av försökspersonerna kommer blod att tas för att extrahera perifera blodmonocytceller (PBMC) för att bedöma det systemiska immunsvaret mot dessa förmodade patogener.

Arbetspaket 3: Karakterisera förändringarna i leverns immunmikromiljö genom att analysera leverbiopsier från patienter. Detta arbetspaket kommer att göras för att belysa de inflammatoriska förändringar som sker i levern som svar på tarmpatogenerna. En liten undergrupp av patienter som genomgår leverbiopsi av kliniska skäl kommer att godkännas för en liten del av levervävnaden utöver vad som krävs för diagnostiska ändamål. Den större delen kommer att skickas iväg för patologisk bedömning. Denna lilla överskottsdel kommer att skäras av från leverbiopsien av radiologen och överlämnas omedelbart till en medlem av forskargruppen. Detta kommer att transporteras i en kolv med flytande kväve till University of Aberdeen lab för bearbetning. Hepatocyter kommer sedan att isoleras från dessa leverbiopsiprover för encellig RNA-sekvensanalys (ScRNAseq). Levervävnad kommer också att användas för att utföra rumslig transkriptomi som kommer att lokalisera det exakta området för metabolisk förändring.