Avaliação de microrganismos e resposta do hospedeiro em doenças hepáticas (MILD)

Finalidade e design:

A questão chave deste estudo de pesquisa é elucidar o papel da microbiota intestinal (bactérias, fungos e vírus) no desenvolvimento e progressão da doença hepática. Existe uma grande quantidade de literatura que sugere que há uma mudança na natureza dos micróbios intestinais nas doenças hepáticas. No entanto, o papel específico do “viroma intestinal” nas doenças hepáticas ainda é um campo emergente. Sua relação com bactérias e fungos no lúmen e interação com o sistema imunológico do hospedeiro precisa ser caracterizada nas doenças hepáticas. Este estudo visa analisar a dinâmica hospedeiro-micróbio nas doenças hepáticas, o que não só levará a uma melhor compreensão da patogénese destas doenças, mas também ajudará na concepção de intervenções terapêuticas para prevenir a progressão. A proposta foi revisada por colegas da Aberdeen Royal Infirmary. Uma divulgação mais ampla dos resultados será feita através de publicações em revistas científicas e através de fóruns de envolvimento público.

Recrutamento:

Os pacientes serão recrutados na clínica Peter Brunt Gastrointestinal (GI) e Fígado, e na enfermaria GI e hepática da Aberdeen Royal Infirmary. Os participantes ambulatoriais receberão fichas de informações dos participantes por correio antes do atendimento clínico, juntamente com a carta de consulta clínica, para que tenham tempo suficiente para compreender as informações. Na consulta clínica, eles serão consentidos por um membro da equipe clínica e lhes será entregue um kit de coleta de amostra fecal. Para pacientes com doença hepática em tratamento na enfermaria, coletaremos amostras fecais após a obtenção do consentimento informado. Informações sobre a causa e o estágio da doença hepática serão coletadas rotineiramente dos registros de casos desses pacientes. Gostaríamos também de obter amostras fecais de um subgrupo de pacientes durante um período mais longo para ver a evolução da microbiota intestinal ao longo do tempo. Solicitaremos mais duas amostras fecais durante um período de seis meses. Serão fornecidos todos os recipientes de coleta necessários e informações para entrega dessas amostras ao laboratório de pesquisa do Instituto de Ciências Médicas da Universidade de Aberdeen. Finalmente, podemos solicitar uma amostra de sangue de um subconjunto de pacientes (n=25) para estudos de desafio. Um total de 30 ml de sangue serão coletados deste subgrupo de pacientes. Esses pacientes serão consentidos especificamente pela equipe clínica.

Um grupo muito pequeno de pacientes será identificado quando forem listados para uma biópsia hepática. Este procedimento é realizado por motivos de diagnóstico ou para estadiar a doença em uma coorte específica de pacientes com doença hepática. A decisão de fazer a biópsia é tomada pelo hepatologista consultor. A biópsia é feita em unidade ambulatorial de forma planejada. Os pacientes recebem uma carta de agendamento para o procedimento. As fichas de informações de participação serão enviadas juntamente com estas cartas, para consideração prévia das informações. Serão consentidos por um membro da equipe clínica no dia da biópsia.

A biópsia hepática é realizada por um radiologista consultor. Uma porção de tecido hepático que exceda a necessária para fins de diagnóstico será cortada da amostra principal. A porção não ultrapassará 0,5 cm com pelo menos 2 cm de tecido hepático enviado ao laboratório para avaliação clínica e patológica. A parcela destinada à pesquisa será guardada e transportada para o laboratório da Universidade de Aberdeen em um frasco de nitrogênio líquido para avaliação do pacote de trabalho 3. As células serão então isoladas dessas amostras para análise de sequenciamento de RNA unicelular (ScRNAseq). O tecido hepático também será utilizado para realizar a transcriptômica espacial que localizará a área exata da alteração metabólica. Essas células também serão usadas para criar organoides de tecidos.

Há duas enfermeiras pesquisadoras do fígado e um pesquisador de Hepatologia que ajudarão na coordenação do estudo. Existem cinco hepatologistas consultores e registradores especializados que ajudarão na identificação de pacientes em potencial. Preveríamos a coleta de 200 conjuntos de amostras de pacientes com doença hepática e um número correspondente de indivíduos de controle adequadamente combinados durante o período de estudo proposto de cinco anos para um estudo mais amplo. Preveríamos 50 indivíduos para o estudo do subgrupo de biópsia hepática no mesmo período.

Os sujeitos de controle serão voluntários saudáveis ​​recrutados na Universidade de Aberdeen e na Aberdeen Royal Infirmary. O estudo será divulgado por meio de panfletos. Os participantes controle serão contatados pela equipe de pesquisa e receberão as fichas de informações de participação que serão enviadas por e-mail ou entregues pessoalmente, 24 horas antes da obtenção do consentimento. Isso garantirá que eles tenham tempo para ler e compreender o estudo de pesquisa. Uma reunião de triagem inicial ocorrerá durante a qual o voluntário conhecerá um membro da equipe de pesquisa. Eles serão solicitados a preencher um questionário básico de saúde detalhando idade, peso e detalhes de quaisquer condições de saúde relevantes e medicação regular para garantir que atendam aos critérios de inclusão/exclusão do estudo. Se atenderem aos critérios de inclusão, serão solicitados a assinar um termo de consentimento e serão formalmente recrutados para o estudo. Eles receberão um número de estudo que será usado em todos os momentos para manter sua identidade anônima.

Um registro de assuntos será mantido para todos os pacientes e controles recrutados no estudo, que será mantido com segurança em um armário trancado na Universidade de Aberdeen.

Metodologia

O estudo será realizado nos laboratórios de pesquisa da Universidade de Aberdeen, do Instituto de Ciências Médicas e do Instituto Rowett. O estudo visa elucidar o papel da microbiota intestinal e da resposta imunológica do hospedeiro na doença hepática através de três pacotes de trabalho descritos abaixo:

Pacote de trabalho 1: Investigação da alteração da microbiota intestinal nas doenças hepáticas

Este pacote de trabalho envolve a coleta de amostras fecais de pacientes elegíveis e controles saudáveis ​​para as seguintes avaliações:

A) Para investigar a alteração da microbiota intestinal em pacientes com doenças hepáticas: As análises moleculares exigirão extração de DNA e RNA de amostras fecais coletadas de pacientes. A avaliação baseada em PCR será empregada usando abordagens universais e também direcionadas a grupos/espécies para estudar a diversidade microbiana. Após a análise por PCR, outros métodos analíticos podem ser empregados, incluindo (mas não exclusivamente) construção de biblioteca de clones e sequenciamento Sanger e também abordagens baseadas em sondagem. Abordagens baseadas em ômicas, como sequenciamento do gene 16sRNA, metagenômica, metatranscriptômica, metabolômica e metaproteômica, também serão usadas para estudar a diversidade e função microbiana.

B) Isolar e caracterizar o potencial patogénico de micróbios específicos associados a doenças hepáticas: A avaliação microbiológica de amostras fecais permitir-nos-á enumerar micróbios específicos (bactérias, vírus e fungos) a partir de amostras utilizando técnicas convencionais de cultura microbiológica. Esses isolados serão então identificados e avaliados quanto ao seu potencial patogenético. Isto envolverá a avaliação genômica da patogenicidade utilizando técnicas como o sequenciamento do genoma completo para caracterizar características específicas. Também realizaremos avaliação metabolômica de micróbios patogênicos para procurar alterações nas vias relativas ao metabolismo de sais biliares, álcool e ácidos graxos de cadeia curta. Isto envolverá avaliação transcriptômica das cepas patogênicas, bem como cromatografia gasosa para estudar os subprodutos do seu metabolismo.

Pacote de trabalho 2: Avaliação da resposta do hospedeiro a micróbios específicos em doenças hepáticas Este pacote de trabalho envolverá a recolha de 30 ml de sangue de pacientes e controlos. Este grupo de indivíduos será consentido especificamente para exames de sangue. Este sangue será usado para gerar macrófagos que serão necessários para os estudos de desafio. Os micróbios patogênicos identificados no Estudo 1 serão avaliados quanto ao seu potencial pró-inflamatório por meio de experimentos de desafio em linhas celulares, organoides de tecidos e modelos experimentais de animais. O sangue coletado no momento do recrutamento será avaliado quanto à evidência de mediadores inflamatórios após desafio com agentes infecciosos identificados no Estudo 1. Sangue total coletado ~ 30 ml (2 colheres de sopa) terá um painel de células bacterianas/virais e fúngicas adicionadas e estas serão ser incubado por até 48 horas. Evidências de desenvolvimento inflamatório serão estudadas usando técnicas moleculares, incluindo (mas não exclusivamente) ELISA e análise citométrica de fluxo. Em uma proporção de indivíduos, o sangue será coletado para extrair células de monócitos do sangue periférico (PBMCs) para avaliar a resposta imune sistêmica contra esses supostos patógenos.

Pacote de trabalho 3: Caracterizar as alterações no microambiente imunológico do fígado através da análise de biópsias hepáticas de pacientes. Este pacote de trabalho será realizado para elucidar as alterações inflamatórias que ocorrem no fígado em resposta aos patógenos intestinais. Um pequeno subgrupo de pacientes submetidos à biópsia hepática por motivos clínicos será consentido para uma pequena porção de tecido hepático além do necessário para fins de diagnóstico. A maior parcela será encaminhada para avaliação patológica. Esse pequeno excesso será cortado da biópsia hepática pelo radiologista e entregue imediatamente a um membro da equipe de pesquisa. Isto será transportado em um frasco de nitrogênio líquido para o laboratório da Universidade de Aberdeen para processamento. Os hepatócitos serão então isolados dessas amostras de biópsia hepática para análise de sequenciamento de RNA unicelular (ScRNAseq). O tecido hepático também será utilizado para realizar a transcriptômica espacial que localizará a área exata da alteração metabólica.