長い非コーディング RNA と、T 細胞の小児急性リンパ芽球性白血病における診断マーカーとしてのエピゲノムにおけるその役割。

具体的な目的 1 T-ALL 患者コホートにおける lncRNA を、健常者由来の T-ナイーブリンパ球および PBMC と比較して評価する。 最適な in vitro モデルの特定。 目的 1 の目標を達成するために、我々は、カンパニア州の腫瘍疾患治療の参照センターであるパウシリポン病院、UO2 に T-ALL に罹患した小児患者のコホートを登録することを計画しました。 患者の募集には、現在の一般データ保護規則に従って、具体的かつ詳細なインフォームドコンセントが使用されます。 収集および処理された生体サンプルは、IRCCS Synlab SDN の機関バイオバンクであり、BBMRI-ERIC インフラストラクチャーのメンバーである SDN Biobank に保管されます。 小児T-ALLは希少がんであり、小児人口における発生率は小児10万人に1人であることを考慮し、16～20人のT-ALL患者を登録する予定である。 私たちの研究室が以前に取得したRNA-seqデータに基づいて、6つの小児T-ALLと臍帯血由来のナイーブT細胞を比較し、示差的に調節される一連のlncRNAを同定した。 これらの中から、一般に白血病、特に小児急性 T 細胞白血病と関連したことがない、最も上方制御されている lncRNA の中から 6 つを選択しました。 選択された 6 つの上方制御された lncRNA は、AC002454.1 (ENSG00000237819)、PCAT18 (ENSG00000265369)、HHIP-AS1 (ENSG00000248890)、LINC01222 (ENSG00000233410)、AC116351.1 (ENSG000002) です。 15246)、AC247036.1 (ENSG00000271201)。 私たちのものや他の RNA-seq 実験の公開データセットを使用して、私たちの提案をコンピュータで確認し、その後の生体サンプルの分析に進みます。 これらの lncRNA の発現レベルは、健常者および小児急性リンパ芽球性 B 細胞性白血病 (B-ALL) 患者由来の PBMC と比較して、選択されたコホートにおいて RT-PCR 実験を使用して ex vivo で分析されます (我々の研究ではすでに存在しています)。 Biobank) を利用して、T-ALL 集団における過剰発現と、B-ALL などの別の小児血液疾患に対する特異性を確認します。 さらに、選択された lncRNA の転写レベルは、T-ALL と B-ALL の両方について、最低 5 つの細胞株モデル疾患で分析されます。 これらのデータにより、その後の機能研究に最適な細胞モデルを選択できるようになります。 lncRNA 発現データは、lncRNA の発現と患者の転帰との相関関係を特定し、有用な T-ALL に特異的な lncRNA の分子シグネチャを取得するために、T-ALL 小児被験者からの臨床データと相互参照されます。診断と小児患者管理の改善のために。

具体的な目的 2 小児 T-ALL 患者と健常者の間で異なるアクセスが可能なシス制御要素の同定、上記で同定された遺伝子座のエピジェネティック修飾の評価、および小児 T-ALL における候補 lncRNA の機能的役割を解明するための遺伝子制御ネットワークのモデリング。 ハイスループットシークエンシングおよびバイオインフォマティクスアプローチの現在の進歩により、lncRNA がエピジェネティック、転写、および転写後レベルで遺伝子発現を調節できることが浮き彫りになりました。 エピジェネティックな側面に関しては、クロマチン構造、DNA メチル化、ヒストン修飾に重大な変化を引き起こす可能性があります。 例えば、lncRNAは、クロマチンフォールディングの直接的または間接的なリモデリングを操作することによって、転写調節因子を特定のゲノム遺伝子座に誘導したり、エンハンサーとプロモーターのコミュニケーションを促進したりする可能性があります。 今日、この種のエピジェネティックな制御機構が、制御されない増殖からアポトーシス耐性に至るまで、悪性腫瘍の発症と進行のさまざまな段階に重大な影響を及ぼし、クロマチンのアクセス可能性やシス制御要素のメチル化状態を変化させ、その結果、異常な遺伝子を引き起こすことがよく知られています。健康な対応物と比較した腫瘍における発現。 エピジェネティックな変化も白血病の重要な要因であることが知られているという事実にもかかわらず、小児患者はもちろんのこと、ALL患者のエピゲノム状況におけるlncRNAの極めて重要な役割の解明はほとんど進んでいない。 特定されている特定の lncRNA はわずかしかなく、潜在的な癌遺伝子または腫瘍抑制因子としてのその調節機能に関する疑問のほとんどは未解決のままであり、さらには疑問さえもたれていない。 目的 2 では、lncRNA、エピジェネティック因子、がん遺伝子発現の間で相互作用する制御ダイナミクスを明らかにします。 私たちは、臍帯血由来のナイーブ T 細胞と比較する T-ALL 小児患者サンプルにおける RNA-seq と ATAC-seq および MmethylC-seq 実験を組み合わせることを計画しています。 ATAC-seq は、通常 H3K4、H3K36、および H3K79 でトリメチル化されている開いたクロマチン領域を捕捉します。これらは通常、シス制御要素と相関します。 T-ALL サンプルの ATACseq は、計算手法を介して推定上の lncRNA とゲノム DNA の結合部位を予測するためのゲノム関心領域を提供します。また、この技術をトランスクリプトミクスおよび機能解析と組み合わせることで、ゲノムのシス制御間の動的な相互作用を生物情報学的にモデル化できるようになります。転写因子、クロマチンリモデリング複合体、lncRNA などのエレメントとトランスエフェクター。 さらに、新たな証拠により、lncRNA と DNA メチル化の間のクロストークも明らかになったため、遺伝子制御ネットワーク モデルを補完し強化するために、MmethylC-seq 技術を使用して一塩基分解能でシトシン DNA メチル化状態のゲノム全体の同定を実行します。 。 T-ALL 患者のエピジェネティックなランドスケープが定義されたら、対照条件と標的 lncRNA のノックダウン時の両方で、T-ALL 細胞株モデルのクロマチンとトランスクリプトームのランドスケープも特徴付けるつもりです (詳細については目的 3 を参照) 。 この実験は、研究中の lncRNA の作動機​​構のモデルを裏付け、鮮明にするのに役立ちます。 機能実験と計算モデルを組み合わせたこの戦略は、小児 TALL におけるエピジェネティックおよびトランスクリプトーム関係の機構的な理解を提供し、とりわけ、診断および治療介入のための新しい戦略への道を開くでしょう。

具体的な目的 3 適切な T-ALL 細胞株モデル系を使用した、エピゲノム修飾に対する同定された lncRNA の役割の評価。

T-ALL患者のエピゲノムを健常者と比較して評価したら、同定されたlncRNAの白血病誘発への関与の評価に進みます。 Aim3 の活動は、この実験段階をサポートするためのすべてのツールとスキルを備えた UO3 と協力して実施されます。 我々は、同定された lncRNA を最高レベルで発現する T-ALL モデル細胞株における一過性のサイレンシングに進みます。 サイレンシング実験では、従来の方法（リポフェクタミンまたはレンチウイルスベクター）または革新的な方法を使用します。 特に、アメリカの企業によって最近開発された方法（FANA-ASO、オリゴヌクレオチド、AUMBiotech、米国）は、トランスフェクション剤を使用せずに造血細胞に侵入できる修飾オリゴヌクレオチドの使用に基づいており、細胞に対して有毒であることが知られています。 FANA-ASO は、古典的なトランスフェクション法ではトランスフェクションが難しい造血モデルにおける標的転写物のサイレンシングに多用されている技術です。 また、lncRNA などの分子に対して高いサイレンシング効率も提供します。

選択された T-ALL モデル システムでは、各 lncRNA が個別にサイレンシングされます。 一過性トランスフェクションの後、サイレンシングの効率は、さまざまな時点で q-RT-PCR によって検証されます。 次に、トランスフェクトされた細胞の生物学的挙動の変化を評価することにより、腫瘍の進行に対する lncRNA ノックダウンの影響を分析することを提案します。

増殖、細胞周期進行、運動能力）、細胞表現型の変化（三次元培養アッセイの実施による）、上皮間葉転換（EMT）、幹細胞マーカー、酸化ストレス、薬物感受性（生存率アッセイまたはIC50の実施による）計算）。 得られた結果に応じて、2 つの lncRNA を同時に使用した共役サイレンシング実験も考慮されます。 選択したモデルに最大の影響を与える lncRNA について、目的 2 で報告した NGS 法の適用を通じて、lncRNA がクロマチン再構成にどのような影響を与えるかを評価し、サイレント化 lncRNA モデルを未処理の対照と比較します。 。 これらのデータにより、同定された lncRNA の発現レベルと白血病 T 細胞における特有のクロマチン変化との関係を評価できるようになります。 これらの実験により、選択された lncRNA に関連する特定の遺伝子制御ネットワークを同定することができました。 実験台から患者のベッドに移る際、小児期の T 芽細胞で選択された lncRNA を直接サイレンシングし、選択された lncRNA の遺伝子制御ネットワークの一部として同定された遺伝子のレベルの変動を評価します。

特定された変化は、治療反応に対する変化の影響を評価するために、疾患の臨床的特徴と関連付けることができます。