Długie niekodujące RNA i ich rola w epigenomie jako markery diagnostyczne w ostrej białaczce limfoblastycznej limfocytów T u dzieci.

Cel szczegółowy 1 Ocena lncRNA w kohorcie pacjentów z T-ALL w porównaniu z limfocytami T-Naive i PBMC od zdrowych osób. Identyfikacja najlepszych odpowiednich modeli in vitro. Aby osiągnąć cel 1, planowaliśmy zapisać kohortę pacjentów pediatrycznych dotkniętych T-ALL w szpitalu Pausilipon, UO2, który jest ośrodkiem referencyjnym w leczeniu chorób onkologicznych w Kampanii. W przypadku rekrutacji pacjentów, zostanie wykorzystana konkretna i szczegółowa świadoma zgoda zgodnie z obowiązującym ogólnym rozporządzeniem o ochronie danych. Pobrane i przetworzone próbki biologiczne będą przechowywane w Biobanku SDN, który jest instytucjonalnym biobankiem IRCCS Synlab SDN i jest członkiem infrastruktury BBMRI-ERIC. Biorąc pod uwagę, że T-ALL u dzieci jest rzadkim nowotworem, a częstość występowania w populacji pediatrycznej wynosi 1 przypadek na 100 000 dzieci, planujemy włączyć do badania 16–20 pacjentów z T-ALL. Wychodząc od danych dotyczących sekwencji RNA uzyskanych wcześniej przez nasze laboratorium, porównując 6 pediatrycznych T-ALL z naiwnymi komórkami T pochodzącymi z krwi pępowinowej, zidentyfikowaliśmy zestaw różnie regulowanych lncRNA. Spośród nich wybraliśmy 6 spośród najbardziej regulowanych w górę lncRNA, które nigdy nie były powiązane z białaczką w ogóle, a w szczególności z ostrą białaczką z komórek T u dzieci. 6 wybranych lncRNA o zwiększonej ekspresji to: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG00000233410), AC116351.1 (ENSG00000215246), AC247036.1 (ENSG00000271201). Korzystając z naszych i innych publicznych zbiorów danych dotyczących eksperymentów seq RNA, potwierdzimy nasze sugestie in silico, a następnie przejdziemy do kolejnych analiz na próbkach biologicznych. Poziomy ekspresji tych lncRNA będą analizowane ex vivo, przy użyciu eksperymentów RT-PCR, w wybranej kohorcie w porównaniu z PBMC pochodzącymi od zdrowych osób i pediatrycznych pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórek B (B-ALL) (już obecnych w naszym badaniu). Biobank) w celu ustalenia nadekspresji w populacji T-ALL i specyficzności w odniesieniu do innej choroby hematologicznej u dzieci, takiej jak B-ALL. Ponadto poziomy transkryptów wybranych lncRNA będą analizowane w co najmniej 5 modelowych liniach komórkowych choroby, zarówno dla T-ALL, jak i B-ALL. Dane te pozwolą nam wybrać najlepsze modele komórkowe do kolejnych badań funkcjonalnych. Dane dotyczące ekspresji lncRNA zostaną porównane z danymi klinicznymi pacjentów pediatrycznych z T-ALL w celu zidentyfikowania korelacji między ekspresją lncRNA a wynikami pacjentów oraz w celu uzyskania sygnatury molekularnej lncRNA specyficznych dla T-ALL, która będzie użyteczna w diagnostyce i doskonaleniu opieki nad pacjentami pediatrycznymi.

Cel szczegółowy 2 Identyfikacja elementów cis-regulacyjnych dostępnych w różny sposób u pacjentów pediatrycznych z T-ALL i zdrowych osób, ocena modyfikacji epigenetycznych loci zidentyfikowanych powyżej oraz modelowanie sieci regulacyjnych genów w celu odkrycia funkcjonalnej roli kandydatów na lncRNA w T-ALL u dzieci. Obecne postępy w wysokoprzepustowym sekwencjonowaniu i podejściach bioinformatycznych uwypukliły, że lncRNA mogą regulować ekspresję genów na poziomie epigenetycznym, transkrypcyjnym i potranskrypcyjnym. Jeśli chodzi o stronę epigenetyczną, mogą one powodować znaczące zmiany w architekturze chromatyny, metylacji DNA i modyfikacjach histonów. Na przykład lncRNA mogą kierować regulatory transkrypcji do określonych loci genomowych lub ułatwiać komunikację wzmacniacz-promotor poprzez bezpośrednią lub pośrednią przebudowę fałdowania chromatyny. Obecnie dobrze wiadomo, że tego rodzaju mechanizmy regulacji epigenetycznej mają krytyczny wpływ na różne etapy pojawiania się i progresji nowotworu złośliwego, od niekontrolowanej proliferacji do oporności na apoptozę, zmieniając dostępność chromatyny i stan metylacji elementów cis-regulacyjnych, a tym samym prowadząc do nieprawidłowego genu ekspresję w nowotworach w porównaniu ze zdrowym odpowiednikiem. Pomimo faktu, że wiadomo, że zmiany epigenetyczne są również kluczowym czynnikiem w białaczce, poczyniono niewielkie postępy w wyjaśnieniu kluczowej roli lncRNA w krajobrazie epigenomicznym WSZYSTKICH pacjentów, nie mówiąc już o pediatrycznych. Zidentyfikowano tylko kilka specyficznych lncRNA, a większość pytań dotyczących ich funkcji regulacyjnej jako potencjalnych onkogenów lub supresorów nowotworów pozostaje bez odpowiedzi, a nawet bez odpowiedzi. W przypadku Celu 2 odkryjemy dynamikę regulacyjną zachodzącą między lncRNA, czynnikami epigenetycznymi i ekspresją onkogenów. Planujemy połączenie RNA-seq z eksperymentami ATAC-seq i MethylC-seq w próbkach pacjentów pediatrycznych T-ALL w porównaniu z naiwnymi komórkami T z krwi pępowinowej. ATAC-seq wychwytuje otwarte regiony chromatyny, zwykle trimetylowane w H3K4, H3K36 i H3K79, które zazwyczaj korelują z elementami cis-regulacyjnymi. ATACseq próbek T-ALL dostarczy genomowych regionów zainteresowania do przewidywania przypuszczalnych miejsc wiązania lncRNA-genom DNA za pomocą metod obliczeniowych, a w połączeniu z transkryptomiką i analizami funkcjonalnymi technologia ta umożliwi nam bioinformatyczne modelowanie dynamicznych interakcji między genomowymi regulatorami cis elementy i transefektory, takie jak czynniki transkrypcyjne, kompleksy przebudowujące chromatynę i lncRNA. Co więcej, w miarę jak nowe dowody odsłoniły przesłuch także między lncRNA a metylacją DNA, przeprowadzimy identyfikację stanów metylacji DNA cytozyny w całym genomie w rozdzielczości pojedynczej zasady za pomocą techniki metyloC-seq, aby uzupełnić i ulepszyć nasz model sieci regulacyjnej genów . Po zdefiniowaniu krajobrazów epigenetycznych pacjentów z T-ALL zamierzamy scharakteryzować także krajobraz chromatyny i transkryptomu w modelach linii komórkowych T-ALL, zarówno w warunkach kontrolnych, jak i po powaleniu docelowych lncRNA (więcej szczegółów można znaleźć w Aim3). . Eksperyment ten pomógłby nam potwierdzić i udoskonalić nasz model mechanizmu działania badanych lncRNA. Ta krzyżowa strategia eksperymentów funkcjonalnych i modeli obliczeniowych zapewni mechanistyczne zrozumienie powiązań epigenetycznych i transkryptomicznych u dzieci z TALL, a przede wszystkim utoruje drogę nowatorskim strategiom interwencji diagnostycznej i terapeutycznej.

Cel szczegółowy 3 Ocena, przy użyciu odpowiednich systemów modelowych linii komórkowych T-ALL, roli zidentyfikowanych lncRNA w modyfikacjach epigenomu.

Po ocenie epigenomu pacjentów z T-ALL w porównaniu ze zdrowymi osobami, przystąpimy do oceny udziału zidentyfikowanych lncRNA w leukemogenezie. Działania Aim3 będą prowadzone we współpracy z UO3, które dysponuje wszystkimi narzędziami i umiejętnościami niezbędnymi do wspierania tej fazy eksperymentalnej. Przejdziemy do przejściowego wyciszenia zidentyfikowanych lncRNA w modelowych liniach komórkowych T-ALL, które wyrażają je na najwyższym poziomie. Do eksperymentów wyciszających wykorzystamy metody tradycyjne (wektory lipofektaminy lub lentiwirusowe) lub innowacyjne. W szczególności metoda opracowana niedawno przez amerykańską firmę (FANA-ASO, oligonukleotyd, AUMBiotech, USA) polegająca na zastosowaniu modyfikowanych oligonukleotydów zdolnych do wniknięcia do komórek krwiotwórczych bez użycia środków transfekcji, o których wiadomo, że są toksyczne dla komórek. FANA-ASO to technologia powszechnie stosowana do wyciszania docelowych transkryptów w modelach krwiotwórczych, które są trudne do transfekcji przy użyciu klasycznych metod transfekcji. Zapewniają również wysoką skuteczność wyciszania cząsteczek takich jak lncRNA.

W wybranych systemach modelowych T-ALL każdy lncRNA będzie wyciszany indywidualnie. Po przejściowej transfekcji skuteczność wyciszenia zostanie zweryfikowana za pomocą q-RT-PCR w różnych punktach czasowych. Następnie proponujemy analizę wpływu knockdown lncRNA na progresję nowotworu poprzez ocenę zmian w zachowaniach biologicznych transfekowanych komórek (tj.

proliferacja, progresja cyklu komórkowego i zdolność poruszania się), zmiany w fenotypie komórek (poprzez wykonanie trójwymiarowego testu hodowli), przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT), markery komórek macierzystych, stres oksydacyjny i wrażliwość na leki (poprzez wykonanie testu żywotności lub IC50 obliczenie). W zależności od uzyskanych wyników rozważone zostaną również eksperymenty wyciszania sprzężonego z dwoma lncRNA jednocześnie. W przypadku lncRNA, które będą miały największy wpływ na wybrane modele, ocenimy, jaki jest wpływ lncRNA na reorganizację chromatyny, poprzez zastosowanie metod NGS opisanych w Celu 2, porównując modele wyciszonego lncRNA w odniesieniu do nietraktowanej kontroli . Dane te pozwolą nam ocenić zależności między poziomami ekspresji zidentyfikowanych lncRNA a specyficznymi zmianami chromatyny w białaczkowych limfocytach T. Eksperymenty te skłoniły nas do zidentyfikowania specyficznej sieci regulacyjnej genów powiązanej z wybranymi lncRNA. Przechodząc od stołu laboratoryjnego do łóżek pacjentów, wyciszymy wybrane lncRNA bezpośrednio w dziecięcych komórkach T-Blast i ocenimy różnice w poziomach genu zidentyfikowanego jako część sieci regulacyjnej genu wybranego lncRNA.

Zidentyfikowane zmiany można następnie skorelować z klinicznymi cechami choroby w celu oceny ich wpływu na odpowiedź terapeutyczną.