长非编码 RNA 及其在表观基因组中作为儿童急性淋巴细胞白血病 T 细胞诊断标记物的作用。

具体目标 1 与健康受试者的 T-Naive 淋巴细胞和 PBMC 相比，评估 T-ALL 患者队列中的 lncRNA。 确定最合适的体外模型。 为了实现目标 1，我们计划在 Pausilipon 医院 UO2 招募一组受 T-ALL 影响的儿科患者，该医院是坎帕尼亚肿瘤疾病治疗的参考中心。 对于患者招募，将根据现行的《通用数据保护条例》使用具体且详细的知情同意书。 收集和处理的生物样本将存储在SDN生物库中，该生物库是IRCCS Synlab SDN的机构生物库，也是BBMRI-ERIC基础设施的成员。 考虑到儿童T-ALL是一种罕见的癌症，儿科人群的发病率为每10万名儿童中就有1例，因此我们计划入组16-20名T-ALL患者。 从我们实验室先前获得的 RNA-seq 数据开始，将 6 个儿童 T-ALL 与源自脐带血的幼稚 T 细胞进行比较，我们确定了一组差异调节的 lncRNA。 从这些中，我们选择了 6 种上调程度最高的 lncRNA，这些 lncRNA 通常与白血病，特别是儿童急性 T 细胞白血病无关。 6个上调的选定lncRNA是：AC002454.1 (ENSG00000237819)、PCAT18 (ENSG00000265369)、HHIP-AS1 (ENSG00000248890)、LINC01222 (ENSG00000233410)、AC116351.1 (ENSG000002152) 46)、AC247036.1 (ENSG00000271201)。 使用我们的和其他公共的 RNA-seq 实验数据集，我们将在计算机上确认我们的建议，然后继续对生物样本进行后续分析。 将使用 RT-PCR 实验在选定的队列中离体分析这些 lncRNA 的表达水平，并与来自健康受试者和儿童 B 细胞急性淋巴细胞白血病 (B-ALL) 患者（已存在于我们的研究中）的 PBMC 进行比较。 Biobank）以确定 T-ALL 群体中的过度表达以及与另一种儿科血液疾病（例如 B-ALL）的特异性。 此外，将在至少 5 个细胞系模型疾病（T-ALL 和 B-ALL）中分析所选 lncRNA 的转录水平。 这些数据将使我们能够为后续的功能研究选择最佳的细胞模型。 lncRNA表达数据将与T-ALL儿科受试者的临床数据交叉引用，以确定lncRNA表达与患者结果之间的相关性，并获得有用的T-ALL特异性lncRNA分子特征用于诊断和改善儿科患者管理。

具体目标 2 鉴定儿科 T-ALL 患者和健康受试者之间存在差异的顺式调控元件，评估上述位点的表观遗传修饰，以及基因调控网络建模以揭示候选 lncRNA 在儿童 T-ALL 中的功能作用。 当前高通量测序和生物信息学方法的进展强调lncRNA可以在表观遗传、转录和转录后水平上调节基因表达。 至于表观遗传方面，它们可以驱动染色质结构、DNA 甲基化和组蛋白修饰的显着变化。 例如，lncRNA 可以引导转录调节因子到达特定基因组位点，或通过直接或间接重塑染色质折叠来促进增强子-启动子通讯。 如今，众所周知，这些表观遗传调控机制对恶性肿瘤发病和进展的不同步骤具有关键影响，从不受控制的增殖到细胞凋亡抵抗，改变顺式调控元件的染色质可及性和甲基化状态，从而导致异常基因相对于健康对应物在肿瘤中的表达。 尽管已知表观遗传改变也是白血病的一个关键因素，但在阐明 lncRNA 对 ALL 患者表观基因组景观的关键作用方面却取得了很少的进展，更不用说儿科患者了。 只有少数特定的 lncRNA 已被识别，并且大多数关于其作为潜在癌基因或肿瘤抑制因子的调节功能的问题仍然没有得到解答，甚至没有被问到。 对于目标 2，我们将揭示 lncRNA、表观遗传因子和癌基因表达之间相互作用的调控动态。 我们计划将 RNA-seq 与 ATAC-seq 和 MmethylC-seq 实验结合起来，在 T-ALL 儿科患者样本中进行实验，并与来自脐带血的初始 T 细胞进行比较。 ATAC-seq 捕获开放染色质区域，通常在 H3K4、H3K36 和 H3K79 处三甲基化，这些区域通常与顺式调控元件相关。 T-ALL 样本的 ATACseq 将提供感兴趣的基因组区域，通过计算方法预测假定的 lncRNA-基因组 DNA 结合位点，并与转录组学和功能分析相结合，该技术将使我们能够对基因组顺式调控之间的动态相互作用进行生物信息建模元件和反式效应子，例如转录因子、染色质重塑复合物和 lncRNA。 此外，随着新的证据发现lncRNA和DNA甲基化之间也存在串扰，我们将通过MmethylC-seq技术以单碱基分辨率对胞嘧啶DNA甲基化状态进行全基因组鉴定，以补充和增强我们的基因调控网络模型。 一旦确定了 T-ALL 患者的表观遗传景观，我们打算在对照条件下和目标 lncRNA 敲低后，对 T-ALL 细胞系模型中的染色质和转录组景观进行表征（更多详细信息，请参阅 Aim3） 。 这个实验将帮助我们证实和完善我们所研究的 lncRNA 的运行机制模型。 这种功能实验和计算模型的交叉策略将为儿科 TALL 的表观遗传和转录组关系提供机械理解，最重要的是，将为诊断和治疗干预的新策略铺平道路。

具体目标 3 使用适当的 T-ALL 细胞系模型系统评估已识别的 lncRNA 对表观基因组修饰的作用。

一旦评估了 T-ALL 患者与健康受试者的表观基因组，我们将继续评估已识别的 lncRNA 在白血病发生中的参与情况。 Aim3 的活动将与 UO3 合作进行，UO3 拥有支持这一实验阶段的所有工具和技能。 我们将在 T-ALL 模型细胞系中对所鉴定的 lncRNA 进行瞬时沉默，这些 lncRNA 的表达水平最高。 对于沉默实验，我们将使用传统（脂质体或慢病毒载体）或创新方法。 特别是，最近由一家美国公司（FANA-ASO，寡核苷酸，AUMBiotech，美国）开发的方法，基于使用能够进入造血细胞的修饰寡核苷酸，而不使用已知对细胞有毒的转染剂。 FANA-ASO 是一种广泛用于沉默造血模型中目标转录本的技术，而造血模型很难使用经典转染方法进行转染。 它们还为 lncRNA 等分子提供高沉默效率。

在选定的 T-ALL 模型系统中，每个 lncRNA 将单独沉默。 瞬时转染后，在不同时间点通过q-RT-PCR验证沉默的效率。 然后，我们建议通过评估转染细胞生物学行为的变化来分析lncRNA敲低对肿瘤进展的影响（即

增殖、细胞周期进程和运动能力）、细胞表型的变化（通过进行三维培养测定）、上皮间质转化（EMT）、干细胞标记物、氧化应激和药物敏感性（通过进行活力测定或 IC50）计算）。 根据获得的结果，还将考虑同时使用两个 lncRNA 进行偶联沉默实验。 对于对所选模型影响最大的 lncRNA，我们将通过应用目标 2 中报告的 NGS 方法来评估 lncRNA 对染色质重组的影响，将沉默的 lncRNA 模型与未处理的对照进行比较。 这些数据将使我们能够评估已识别的 lncRNA 的表达水平与白血病 T 细胞中特殊的染色质改变之间的关系。 这些实验促使我们确定与所选 lncRNA 相关的特定基因调控网络。 从实验室工作台到病床，我们将直接在儿童T-Blasts中沉默所选的lncRNA，并且我们将评估被识别为所选lncRNA基因调控网络一部分的基因水平的变化。

然后可以将识别出的改变与疾病的临床特征相关联，以评估它们对治疗反应的影响。