Dlouhé nekódující RNA a jejich role na epigenomu jako diagnostických markerů v dětské akutní lymfoblastické leukémii T buněk.

Specifický cíl 1 Vyhodnocení lncRNA u kohorty pacientů s T-ALL ve srovnání s T-naivními lymfocyty a PBMC od zdravých subjektů. Identifikace nejvhodnějších in vitro modelů. Abychom dosáhli cíle Cíle 1, naplánovali jsme zařazení kohorty dětských pacientů postižených T-ALL do nemocnice Pausilipon, UO2, která je referenčním centrem pro léčbu onkologických onemocnění v Kampánii. Pro nábor pacientů bude použit konkrétní a podrobný informovaný souhlas podle aktuálního obecného nařízení o ochraně osobních údajů. Odebrané a zpracované biologické vzorky budou uloženy v SDN Biobank, která je institucionální biobankou IRCCS Synlab SDN a je členem infrastruktury BBMRI-ERIC. Vzhledem k tomu, že dětská T-ALL je vzácná rakovina s incidencí v dětské populaci 1 případ na 100 000 dětí, plánujeme zařadit 16–20 pacientů s T-ALL. Počínaje daty RNA-seq dříve získanými naší laboratoří, srovnáním 6 dětských T-ALL s naivními T-buňkami získanými z pupečníkové krve, jsme identifikovali soubor odlišně regulovaných lncRNA. Z nich jsme vybrali 6 z nejvíce up-regulovaných lncRNA, které nebyly nikdy spojeny s leukémií obecně, a konkrétně s pediatrickou akutní leukémií T-buněk. 6 upregulovaných vybraných lncRNA je: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC011222 (ENSG00100021502),2303 AC0400021502 6), AC247036.1 (ENSG00000271201). Pomocí našich a dalších veřejných datových souborů experimentů RNA-seq potvrdíme naše návrhy in silico a poté přistoupíme k následným analýzám biologických vzorků. Hladiny exprese těchto lncRNA budou analyzovány ex vivo pomocí experimentů RT-PCR ve vybrané kohortě ve srovnání s PBMC odvozenými od zdravých subjektů a pediatrických pacientů s akutní lymfoblastickou leukémií B-buněk (B-ALL) (již přítomnou v našem Biobanka), aby se zjistila nadměrná exprese v populaci T-ALL a specificita s ohledem na jiné dětské hematologické onemocnění, jako je B-ALL. Kromě toho budou hladiny transkriptů vybraných lncRNA analyzovány v minimálně 5 buněčných liniích modelového onemocnění, pro T-ALL i B-ALL. Tato data nám umožní vybrat nejlepší buněčné modely pro následné funkční studie. Data exprese lncRNA budou křížově odkazována s klinickými daty od pediatrických subjektů T-ALL, aby se identifikovala korelace mezi expresí lncRNA a výsledky pacientů a aby se získal molekulární podpis lncRNA specifických pro T-ALL, který bude užitečný. pro diagnostiku a pro zlepšení péče o dětské pacienty.

Specifický cíl 2 Identifikace cis-regulačních elementů odlišně dostupných mezi pediatrickými pacienty s T-ALL a zdravými subjekty, hodnocení epigenetických modifikací výše identifikovaných lokusů a modelování genových regulačních sítí k odhalení funkční role kandidátních lncRNA v dětské T-ALL. Současné pokroky ve vysoce výkonném sekvenování a bioinformatických přístupech zdůraznily, že lncRNA mohou regulovat genovou expresi na epigenetické, transkripční a post-transkripční úrovni. Pokud jde o epigenetickou stránku, mohou řídit významné změny v architektuře chromatinu, metylaci DNA a modifikacích histonů. Například lncRNA mohou navádět regulátory transkripce do specifických genomových lokusů nebo usnadňovat komunikaci zesilovač-promotor tím, že řídí přímou nebo nepřímou remodelaci skládání chromatinu. Dnes je dobře známo, že tyto druhy epigenetických regulačních mechanismů mají kritický dopad na různé kroky nástupu a progrese zhoubného bujení, od nekontrolované proliferace po rezistenci na apoptózu, mění přístupnost chromatinu a stav metylace cis-regulačních elementů, což vede k aberantnímu genu. expresi v nádorech s ohledem na zdravý protějšek. Navzdory skutečnosti, že je známo, že epigenetické změny jsou také klíčovým faktorem u leukémie, bylo učiněno jen málo pokroků k objasnění klíčové role lncRNA v epigenomické krajině pacientů se ALL, natož dětských. Bylo identifikováno pouze několik specifických lncRNA a většina otázek týkajících se jejich regulační funkce jako potenciálních onkogenů nebo nádorových supresorů zůstává nezodpovězena a dokonce ani položena. Pro Cíl 2 odhalíme regulační dynamiku, která se promítá mezi lncRNA, epigenetickými faktory a expresí onkogenů. Plánujeme spojit RNA-seq s experimenty ATAC-seq a MethylC-seq ve vzorcích pediatrických pacientů T-ALL ve srovnání s naivními T-buňkami z pupečníkové krve. ATAC-seq zachycuje otevřené chromatinové oblasti, obvykle trimethylované na H3K4, H3K36 a H3K79, které typicky korelují s cis-regulačními prvky. ATACseq vzorků T-ALL poskytne genomové oblasti zájmu k predikci domnělých vazebných míst lncRNA-genom DNA pomocí výpočetních metod a v kombinaci s transkriptomikou a funkčními analýzami nám tato technologie umožní bioinformaticky modelovat dynamické interakce mezi genomovými cis-regulačními prvky a trans-efektory, jako jsou transkripční faktory, komplexy remodelující chromatin a lncRNA. Dále, protože nové důkazy odhalily přeslech také mezi lncRNA a methylací DNA, provedeme celogenomovou identifikaci stavů metylace cytosinové DNA v rozlišení jedné báze pomocí techniky MethylC-seq, abychom doplnili a vylepšili náš model genové regulační sítě. . Jakmile budou definovány epigenetické krajiny pacientů s T-ALL, máme v úmyslu charakterizovat také chromatinovou a transkriptomickou krajinu v modelech buněčných linií T-ALL, a to jak v kontrolních podmínkách, tak po knockdownu cílových lncRNA (další podrobnosti viz Cíl 3) . Tento experiment by nám pomohl potvrdit a zpřesnit náš model operačního mechanismu pro zkoumané lncRNA. Tato křížová strategie funkčních experimentů a výpočtových modelů poskytne mechanické pochopení epigenetických a transkriptomických vztahů v pediatrické TALL a především připraví cestu k novým strategiím pro diagnostickou a terapeutickou intervenci.

Specifický cíl 3 Vyhodnocení úlohy identifikovaných lncRNA na modifikace epigenomu za použití vhodných systémů modelu buněčné linie T-ALL.

Po vyhodnocení epigenomu pacientů s T-ALL ve srovnání se zdravými subjekty přistoupíme k posouzení zapojení identifikovaných lncRNA do leukemogeneze. Aktivity Aim3 budou prováděny ve spolupráci s UO3, který má všechny nástroje a dovednosti pro podporu této experimentální fáze. Přistoupíme k přechodnému umlčení identifikovaných lncRNA v modelových buněčných liniích T-ALL, které je exprimují na nejvyšší úrovni. Pro umlčovací experimenty použijeme tradiční (lipofectamine nebo lentivirové vektory) nebo inovativní metody. Zejména metoda nedávno vyvinutá americkou společností (FANA-ASO, oligonukleotid, AUMBiotech, USA) založená na použití modifikovaných oligonukleotidů schopných vstupovat do krvetvorných buněk bez použití transfekčních činidel, o nichž je známo, že jsou pro buňky toxické. FANA-ASO je technologie hojně využívaná pro umlčování cílových transkriptů v hematopoetických modelech, které je obtížné transfekovat klasickými transfekčními metodami. Poskytují také vysokou účinnost umlčování pro molekuly, jako jsou lncRNA.

Ve vybraných modelových systémech T-ALL bude každá lncRNA umlčena individuálně. Po přechodné transfekci bude účinnost umlčování ověřena pomocí q-RT-PCR v různých časových bodech. Poté navrhujeme analyzovat účinky knockdownu lncRNA na progresi nádoru vyhodnocením změn v biologickém chování transfekovaných buněk (tj.

proliferace, progrese buněčného cyklu a schopnosti motility), změny ve fenotypu buněk (provedením trojrozměrného kultivačního testu), epiteliálně-mezenchymální přechod (EMT), markery kmenových buněk, oxidační stres a citlivost na léky (provedením testu viability nebo IC50 výpočet). V závislosti na získaných výsledcích budou také zvažovány experimenty spojeného umlčení se dvěma lncRNA současně. U lncRNA, které budou mít největší účinek na vybrané modely, vyhodnotíme, jaké jsou účinky, které mají lncRNA na reorganizaci chromatinu, prostřednictvím aplikace metod NGS uvedených v cíli 2, porovnáním umlčených modelů lncRNA s ohledem na neošetřenou kontrolu. . Tato data nám umožní vyhodnotit vztahy mezi úrovněmi exprese identifikovaných lncRNA a zvláštními změnami chromatinu v leukemických T buňkách. Tyto experimenty nás přiměly identifikovat specifickou genovou regulační síť spojenou s vybranými lncRNA. Přechodem z laboratorní lavice na lůžka pacientů umlčíme vybrané lncRNA přímo v dětských T-Blastech a vyhodnotíme variace v hladinách genu identifikovaného jako součást genové regulační sítě vybrané lncRNA.

Identifikované změny by pak mohly být korelovány s klinickými rysy onemocnění, aby se vyhodnotil jejich dopad na terapeutickou odpověď.