Lange nichtkodierende RNAs und ihre Rolle im Epigenom als diagnostische Marker bei akuter lymphoblastischer T-Zellen-Leukämie im Kindesalter.

Spezifisches Ziel 1 Bewertung von lncRNAs in einer Kohorte von T-ALL-Patienten im Vergleich mit T-naiven Lymphozyten und PBMC von gesunden Probanden. Identifizierung der am besten geeigneten In-vitro-Modelle. Um das Ziel von Ziel 1 zu erreichen, planten wir die Aufnahme einer Kohorte pädiatrischer Patienten mit T-ALL im Pausilipon-Krankenhaus, dem UO2, einem Referenzzentrum für die Behandlung onkologischer Erkrankungen in Kampanien. Für die Patientenrekrutierung wird eine spezifische und detaillierte Einwilligung nach Aufklärung gemäß der aktuellen Datenschutz-Grundverordnung verwendet. Die gesammelten und verarbeiteten biologischen Proben werden in der SDN-Biobank gespeichert, der institutionellen Biobank des IRCCS Synlab SDN und Mitglied der BBMRI-ERIC-Infrastruktur. In Anbetracht der Tatsache, dass es sich bei T-ALL im Kindesalter um eine seltene Krebserkrankung mit einer Inzidenz in der pädiatrischen Bevölkerung von 1 Fall pro 100.000 Kindern handelt, planen wir die Aufnahme von 16–20 T-ALL-Patienten. Ausgehend von RNA-seq-Daten, die zuvor von unserem Labor erhalten wurden, verglichen wir 6 pädiatrische T-ALL mit naiven T-Zellen aus Nabelschnurblut und identifizierten einen Satz unterschiedlich regulierter lncRNAs. Aus diesen haben wir sechs der am stärksten hochregulierten lncRNAs ausgewählt, die nie mit Leukämie im Allgemeinen und akuter T-Zell-Leukämie bei Kindern im Besonderen in Verbindung gebracht wurden. Die 6 hochregulierten ausgewählten lncRNAs sind: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG00000233410), AC116351.1 (ENSG00000215246). ), AC247036.1 (ENSG00000271201). Anhand unserer und anderer öffentlicher Datensätze von RNA-seq-Experimenten werden wir unsere Vorschläge in silico bestätigen und dann mit nachfolgenden Analysen an biologischen Proben fortfahren. Die Expressionsniveaus dieser lncRNAs werden ex vivo mithilfe von RT-PCR-Experimenten in der ausgewählten Kohorte im Vergleich zu PBMCs analysiert, die von gesunden Probanden und pädiatrischen Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie von B-Zellen (B-ALL) stammen (in unserem Fall bereits vorhanden). Biobank), um die Überexpression in der T-ALL-Population und die Spezifität in Bezug auf eine andere pädiatrische hämatologische Erkrankung wie B-ALL festzustellen. Darüber hinaus werden die Transkriptniveaus der ausgewählten lncRNAs in mindestens 5 Zelllinien-Modellkrankheiten analysiert, sowohl für T-ALL als auch für B-ALL. Diese Daten werden es uns ermöglichen, die besten Zellmodelle für nachfolgende Funktionsstudien auszuwählen. Die lncRNA-Expressionsdaten werden mit klinischen Daten von pädiatrischen T-ALL-Probanden abgeglichen, um eine Korrelation zwischen der Expression der lncRNAs und den Patientenergebnissen zu identifizieren und eine molekulare Signatur von für T-ALL spezifischen lncRNAs zu erhalten, die nützlich sein wird zur Diagnose und zur Verbesserung des pädiatrischen Patientenmanagements.

Spezifisches Ziel 2: Identifizierung von cis-regulatorischen Elementen, die bei pädiatrischen T-ALL-Patienten und gesunden Probanden unterschiedlich zugänglich sind, Bewertung epigenetischer Modifikationen der oben identifizierten Loci und Modellierung genregulatorischer Netzwerke, um die funktionelle Rolle von lncRNA-Kandidaten bei T-ALL im Kindesalter aufzuklären. Aktuelle Fortschritte bei Hochdurchsatzsequenzierung und bioinformatischen Ansätzen haben gezeigt, dass lncRNAs die Genexpression auf epigenetischer, transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene regulieren können. Was die epigenetische Seite betrifft, können sie erhebliche Veränderungen in der Chromatinarchitektur, der DNA-Methylierung und Histonmodifikationen bewirken. Beispielsweise können lncRNAs Transkriptionsregulatoren zu bestimmten genomischen Loci leiten oder die Enhancer-Promotor-Kommunikation erleichtern, indem sie eine direkte oder indirekte Umgestaltung der Chromatinfaltung bewirken. Heute ist bekannt, dass diese Art von epigenetischen Regulationsmechanismen einen entscheidenden Einfluss auf verschiedene Schritte des Ausbruchs und Fortschreitens einer Malignität haben, von der unkontrollierten Proliferation bis zur Apoptoseresistenz, indem sie die Zugänglichkeit des Chromatins und den Methylierungszustand von cis-regulatorischen Elementen verändern und somit zu aberranten Genen führen Expression in Tumoren im Vergleich zum gesunden Gegenstück. Obwohl bekannt ist, dass epigenetische Veränderungen auch bei Leukämie ein Schlüsselfaktor sind, wurden kaum Fortschritte bei der Aufklärung der zentralen Rolle von lncRNAs in der epigenomischen Landschaft ALLER Patienten erzielt, ganz zu schweigen von pädiatrischen Patienten. Es wurden nur wenige spezifische lncRNAs identifiziert und die meisten Fragen zu ihrer regulatorischen Funktion als potenzielle Onkogene oder Tumorsuppressoren bleiben unbeantwortet und werden sogar nicht gestellt. Für Ziel 2 werden wir die regulatorische Dynamik enthüllen, die zwischen lncRNAs, epigenetischen Faktoren und der Onkogenexpression zusammenspielt. Wir planen, RNA-seq- mit ATAC-seq- und MethylC-seq-Experimenten in pädiatrischen T-ALL-Patientenproben im Vergleich zu naiven T-Zellen aus Nabelschnurblut zu koppeln. ATAC-seq erfasst offene Chromatinregionen, die normalerweise an H3K4, H3K36 und H3K79 trimethyliert sind und typischerweise mit cis-regulatorischen Elementen korrelieren. ATACseq von T-ALL-Proben wird genomische Regionen von Interesse liefern, um mutmaßliche lncRNA-Genom-DNA-Bindungsstellen mithilfe rechnerischer Methoden vorherzusagen. In Kombination mit Transkriptomik und Funktionsanalysen wird diese Technologie es uns ermöglichen, die dynamischen Wechselwirkungen zwischen genomischer cis-Regulation bioinformatisch zu modellieren Elemente und Transeffektoren wie Transkriptionsfaktoren, Chromatin-Remodelling-Komplexe und lncRNAs. Da neue Erkenntnisse einen Crosstalk auch zwischen lncRNAs und DNA-Methylierung aufgedeckt haben, werden wir außerdem eine genomweite Identifizierung von Cytosin-DNA-Methylierungszuständen mit Einzelbasenauflösung mithilfe der MethylC-seq-Technik durchführen, um unser genregulatorisches Netzwerkmodell zu ergänzen und zu verbessern . Sobald die epigenetischen Landschaften von T-ALL-Patienten definiert sind, beabsichtigen wir, auch die Chromatin- und Transkriptomlandschaft in T-ALL-Zelllinienmodellen zu charakterisieren, sowohl unter Kontrollbedingungen als auch nach dem Abbau der Ziel-lncRNAs (weitere Einzelheiten siehe Aim3). . Dieses Experiment würde uns helfen, unser Modell des Wirkmechanismus der untersuchten lncRNAs zu bestätigen und zu schärfen. Diese übergreifende Strategie aus Funktionsexperimenten und Rechenmodellen wird ein mechanistisches Verständnis der epigenetischen und transkriptomischen Beziehungen bei pädiatrischen TALL liefern und vor allem den Weg für neuartige Strategien für diagnostische und therapeutische Interventionen ebnen.

Spezifisches Ziel 3: Bewertung der Rolle identifizierter lncRNAs bei Epigenommodifikationen unter Verwendung geeigneter T-ALL-Zelllinien-Modellsysteme.

Sobald wir das Epigenom von T-ALL-Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden ausgewertet haben, werden wir mit der Beurteilung der Beteiligung identifizierter lncRNAs an der Leukämogenese fortfahren. Die Aktivitäten von Aim3 werden in Zusammenarbeit mit der UO3 durchgeführt, die über alle Werkzeuge und Fähigkeiten verfügt, um diese experimentelle Phase zu unterstützen. Wir werden mit der vorübergehenden Stummschaltung der identifizierten lncRNAs in den T-ALL-Modellzelllinien fortfahren, die sie in den höchsten Mengen exprimieren. Für die Silencing-Experimente werden wir traditionelle (Lipofectamin oder lentivirale Vektoren) oder innovative Methoden verwenden. Insbesondere eine kürzlich von einem amerikanischen Unternehmen (FANA-ASO, Oligonukleotid, AUMBiotech, USA) entwickelte Methode, die auf der Verwendung modifizierter Oligonukleotide basiert, die ohne den Einsatz von Transfektionsmitteln in hämatopoetische Zellen eindringen können und bekanntermaßen toxisch für Zellen sind. Die FANA-ASO ist eine Technologie, die häufig zur Stummschaltung von Zieltranskripten in hämatopoetischen Modellen eingesetzt wird, die mit klassischen Transfektionsmethoden schwer zu transfizieren sind. Sie bieten außerdem eine hohe Stummschaltungseffizienz für Moleküle wie lncRNAs.

In den ausgewählten T-ALL-Modellsystemen wird jede lncRNA einzeln zum Schweigen gebracht. Nach der transienten Transfektion wird die Effizienz der Stummschaltung durch q-RT-PCR zu verschiedenen Zeitpunkten überprüft. Anschließend schlagen wir vor, die Auswirkungen des lncRNA-Knockdowns auf das Fortschreiten des Tumors zu analysieren, indem wir Änderungen im biologischen Verhalten der transfizierten Zellen (d. h.

Proliferation, Fortschreiten des Zellzyklus und Motilitätsfähigkeiten), Veränderungen im Zellphänotyp (durch Durchführung eines dreidimensionalen Kulturtests), epithelial-mesenchymaler Übergang (EMT), Stammzellmarker, oxidativer Stress und Arzneimittelempfindlichkeit (durch Durchführung eines Lebensfähigkeitstests oder IC50). Berechnung). Abhängig von den erzielten Ergebnissen werden auch gekoppelte Silencing-Experimente mit zwei lncRNAs gleichzeitig in Betracht gezogen. Für die lncRNAs, die den größten Einfluss auf die ausgewählten Modelle hatten, werden wir die Auswirkungen von lncRNAs auf die Chromatin-Reorganisation bewerten, indem wir die in Ziel 2 beschriebenen NGS-Methoden anwenden und stummgeschaltete lncRNA-Modelle mit der unbehandelten Kontrolle vergleichen . Diese Daten werden es uns ermöglichen, die Beziehungen zwischen den Expressionsniveaus identifizierter lncRNAs und besonderen Chromatinveränderungen in leukämischen T-Zellen zu bewerten. Diese Experimente veranlassten uns, ein spezifisches Genregulationsnetzwerk zu identifizieren, das mit den ausgewählten lncRNAs verbunden ist. Auf dem Weg vom Labortisch zu den Patientenbetten werden wir die ausgewählten lncRNAs direkt in den T-Blasts der Kindheit zum Schweigen bringen und die Variationen in den Spiegeln des Gens bewerten, das als Teil des genregulatorischen Netzwerks der ausgewählten lncRNA identifiziert wurde.

Die identifizierten Veränderungen könnten dann mit den klinischen Merkmalen der Krankheit korreliert werden, um ihren Einfluss auf das therapeutische Ansprechen zu bewerten.