Lange ikke-kodende RNA'er og deres rolle på epigenom som diagnostiske markører i akut lymfoblastisk leukæmi i børn i T-celler.

Specifikt mål 1 Evaluering af lncRNA'er i en kohorte af T-ALL-patienter i sammenligning med T-naive lymfocytter og PBMC fra raske forsøgspersoner. Identifikation af de bedst egnede in vitro-modeller. For at nå målet med mål 1 planlagde vi at indskrive en kohorte af pædiatriske patienter ramt af T-ALL på Pausilipon hospitalet, UO2, som er et referencecenter for behandling af onkologiske sygdomme i Campania. Til patientrekruttering vil der blive brugt specifikt og detaljeret informeret samtykke i henhold til den nuværende generelle databeskyttelsesforordning. De indsamlede og behandlede biologiske prøver vil blive opbevaret i SDN Biobank, som er den institutionelle biobank for IRCCS Synlab SDN og er medlem af BBMRI-ERIC infrastrukturen. I betragtning af, at barndoms T-ALL er sjælden cancer, med en forekomst i den pædiatriske population på 1 tilfælde for hver 100.000 børn, planlægger vi at indskrive 16-20 T-ALL patienter. Med udgangspunkt i RNA-seq-data, der tidligere var opnået af vores laboratorium, sammenlignede 6 pædiatriske T-ALL med naive T-celler afledt af navlestrengsblod, identificerede vi et sæt differentielt regulerede lncRNA'er. Fra disse udvalgte vi 6 blandt de mest opregulerede lncRNA'er, der aldrig har været forbundet med leukæmi generelt, og pædiatrisk akut T-celle leukæmi i særdeleshed. De 6 opregulerede udvalgte lncRNA'er er: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG0041005), (306102010101010101001010100020100101000100010001000100010001000100010001000100020001002010020100201001000265369) 6), AC247036.1 (ENSG00000271201). Ved at bruge vores og andre offentlige datasæt af RNA-seq eksperimenter, vil vi bekræfte vores forslag i silico og derefter fortsætte til efterfølgende analyser på biologiske prøver. Ekspressionsniveauerne af disse lncRNA'er vil blive analyseret ex vivo ved hjælp af RT-PCR-eksperimenter i den udvalgte kohorte i sammenligning med PBMC'er afledt af raske forsøgspersoner og pædiatriske akut lymfatisk leukæmi af B-celler (B-ALL) patienter (allerede til stede i vores Biobank) for at fastslå overekspression i T-ALL-populationen og specificitet med hensyn til en anden pædiatrisk hæmatologisk sygdom, såsom B-ALL. Desuden vil transkriptniveauerne af de udvalgte lncRNA'er blive analyseret i minimum 5 cellelinier modelsygdom, for både T-ALL og B-ALL. Disse data vil give os mulighed for at vælge de bedste cellulære modeller til efterfølgende funktionelle undersøgelser. LncRNA-ekspressionsdataene vil blive krydsrefereret med kliniske data fra T-ALL pædiatriske forsøgspersoner for at identificere en sammenhæng mellem ekspressionen af ​​lncRNA'erne og patientresultater og for at opnå en molekylær signatur af lncRNA'er, der er specifikke for T-ALL, som vil være nyttige til diagnosticering og til forbedring af pædiatrisk patientbehandling.

Specifikt mål 2 Identifikation af cis-regulatoriske elementer, der er differentielt tilgængelige mellem pædiatriske T-ALL-patienter og raske forsøgspersoner, evaluering af epigenetiske modifikationer af de ovenfor identificerede loci og genregulerende netværk, der modellerer for at optrevle den funktionelle rolle af kandidat-lncRNA'er i barndommens T-ALL. Aktuelle fremskridt inden for high-throughput sekventering og bioinformatiske tilgange fremhævede, at lncRNA'er kan regulere genekspression på epigenetiske, transkriptionelle og post-transkriptionelle niveauer. Hvad angår den epigenetiske side, kan de drive betydelige ændringer i kromatinarkitektur, DNA-methylering og histonmodifikationer. For eksempel kan lncRNA'er guide transkriptionelle regulatorer til specifikke genomiske loci eller lette forstærker-promotor-kommunikationen ved at udføre en direkte eller indirekte remodellering af kromatinfoldningen. I dag er det velkendt, at disse former for epigenetiske reguleringsmekanismer har en kritisk indvirkning på forskellige trin af malignitets begyndelse og progression, fra ukontrolleret spredning til apoptoseresistens, ændring af kromatintilgængeligheden og methyleringstilstanden af ​​cis-regulerende elementer og derfor fører til afvigende gen. udtryk i tumorer i forhold til den raske modpart. På trods af det faktum, at epigenetiske ændringer også er kendt for at være en nøglefaktor i leukæmi, er der gjort knappe fremskridt for at belyse lncRNA'ers centrale rolle i det epigenomiske landskab hos ALLE patienter, endsige pædiatriske. Kun få specifikke lncRNA'er er blevet identificeret, og de fleste af spørgsmålene om deres regulatoriske funktion som potentielle onkogener eller tumor-suppressorer forbliver ubesvarede og endda ustillede. For mål 2 vil vi afsløre den regulatoriske dynamik, der spiller sammen mellem lncRNA'er, epigenetiske faktorer og onkogenekspression. Vi planlægger at koble RNA-seq med ATAC-seq og MethylC-seq eksperimenter i T-ALL pædiatriske patientprøver i sammenligning med naive T-celler fra navlestrengsblod. ATAC-seq fanger åbne kromatinregioner, normalt trimethyleret ved H3K4, H3K36 og H3K79, som typisk korrelerer med cis-regulatoriske elementer. ATACseq af T-ALL-prøver vil give genomiske områder af interesse til at forudsige formodede lncRNA-genom-DNA-bindingssteder via beregningsmetoder, og i kombination med transkriptomik og funktionelle analyser vil denne teknologi give os mulighed for bioinformatisk at modellere de dynamiske interaktioner mellem genomisk cis-regulatorisk elementer og trans-effektorer såsom transkriptionsfaktorer, kromatin-ombygningskomplekser og lncRNA'er. Yderligere, da nye beviser har afsløret en krydstale også mellem lncRNA'er og DNA-methylering, vil vi udføre en genom-dækkende identifikation af cytosin-DNA-methyleringstilstande ved enkeltbase-opløsning gennem MethylC-seq-teknik for at komplementere og forbedre vores genregulerende netværksmodel . Når de epigenetiske landskaber af T-ALL-patienter er blevet defineret, agter vi også at karakterisere kromatin- og transkriptomiske landskaber i T-ALL-cellelinjemodeller, både under kontrolforhold og ved knockdown af mål-lncRNA'erne (se Aim3 for yderligere detaljer) . Dette eksperiment ville hjælpe os med at bekræfte og skærpe vores model af driftsmekanismen for lncRNA'er under undersøgelse. Denne tværgående strategi af funktionelle eksperimenter og beregningsmodeller vil give mekanistisk forståelse af epigenetiske og transkriptomiske relationer i pædiatrisk TALL og vil frem for alt bane vejen for nye strategier for diagnostisk og terapeutisk intervention.

Specifikt mål 3 Evaluering, ved hjælp af passende T-ALL-cellelinjemodelsystemer, af rollen af ​​identificerede lncRNA'er på epigenom-modifikationer.

Når vi har evalueret epigenomet af T-ALL-patienter i sammenligning med raske forsøgspersoner, vil vi fortsætte med at vurdere involveringen af ​​identificerede lncRNA'er i leukomogenese. Aktiviteterne i Aim3 vil blive gennemført i samarbejde med UO3, som har alle værktøjer og færdigheder til at understøtte denne eksperimentelle fase. Vi vil fortsætte til den forbigående dæmpning af de identificerede lncRNA'er i T-ALL-modelcellelinjerne, der udtrykker dem på de højeste niveauer. Til lyddæmpningseksperimenterne vil vi bruge traditionelle (lipofectamin eller lentivirale vektorer) eller innovative metoder. Især en metode, der for nylig er udviklet af et amerikansk firma (FANA-ASO, oligonukleotid, AUMBiotech, USA) baseret på brugen af ​​modificerede oligonukleotider, der kan trænge ind i hæmatopoietiske celler uden brug af transfektionsmidler, der vides at være giftige for celler. FANA-ASO er en teknologi, der er rigeligt brugt til at dæmpe måltranskripter i hæmatopoietiske modeller, som er vanskelige at transficere ved hjælp af klassiske transfektionsmetoder. De giver også høj lyddæmpningseffektivitet for molekyler såsom lncRNA'er.

I de valgte T-ALL-modelsystemer vil hvert lncRNA blive dæmpet individuelt. Efter den forbigående transfektion vil effektiviteten af ​​lyddæmpningen blive verificeret af q-RT-PCR på forskellige tidspunkter. Derefter foreslår vi at analysere virkningerne af lncRNA knockdown på tumorprogression ved at evaluere ændringer i biologisk adfærd af de transficerede celler (dvs.

proliferation, cellecyklusprogression og bevægelighedsevner), ændringer i cellefænotype (ved at udføre tredimensionel kulturanalyse), epitel-mesenkymal overgang (EMT), stamcellemarkører, oxidativt stress og lægemiddelfølsomhed (ved at udføre levedygtighedsassay eller IC50) beregning). Afhængigt af de opnåede resultater vil koblede lyddæmpningseksperimenter med to lncRNA'er samtidigt også blive overvejet. For de lncRNA'er, der vil have haft den største effekt på de udvalgte modeller, vil vi evaluere, hvilke virkninger lncRNA'er har på kromatin-reorganisering, ved at anvende NGS-metoderne rapporteret i mål 2, og sammenligne silented lncRNA-modeller i forhold til den ubehandlede kontrol . Disse data vil give os mulighed for at evaluere forholdet mellem ekspressionsniveauerne af identificerede lncRNA'er og ejendommelige kromatinændringer i leukæmi-T-celler. Disse eksperimenter fik os til at identificere et specifikt genregulerende netværk forbundet med de udvalgte lncRNA'er. Ved at gå fra laboratoriebænken til patientsengene vil vi tavse de udvalgte lncRNA'er direkte i barndommens T-blaster, og vi vil evaluere variationerne i niveauerne af genet identificeret som en del af det genregulerende netværk af det udvalgte lncRNA.

De identificerede ændringer kunne derefter korreleres med de kliniske træk ved sygdommen for at evaluere deres indvirkning på terapeutisk respons.