Длинные некодирующие РНК и их роль в эпигеноме как диагностические маркеры при остром лимфобластном лейкозе Т-клеток у детей.

Конкретная цель 1. Оценка lncRNAs в когорте пациентов с T-ALL в сравнении с T-наивными лимфоцитами и PBMC здоровых людей. Определение наиболее подходящих моделей in vitro. Для достижения цели 1 мы планировали набрать группу педиатрических пациентов, страдающих Т-ОЛЛ, в больнице Паусилипон, UO2, которая является референс-центром по лечению онкологических заболеваний в Кампании. Для набора пациентов будет использоваться конкретное и подробное информированное согласие в соответствии с действующими Общими правилами защиты данных. Собранные и обработанные биологические образцы будут храниться в биобанке SDN, который является институциональным биобанком IRCCS Synlab SDN и является членом инфраструктуры BBMRI-ERIC. Учитывая, что детский Т-ОЛЛ является редким раком, частота встречаемости которого в педиатрической популяции составляет 1 случай на 100 000 детей, мы планируем включить в исследование 16-20 пациентов с Т-ОЛЛ. Опираясь на данные секвенирования РНК, ранее полученные в нашей лаборатории, сравнивая 6 педиатрических Т-ОЛЛ с наивными Т-клетками, полученными из пуповинной крови, мы идентифицировали набор дифференциально регулируемых днРНК. Из них мы выбрали 6 днРНК с наиболее высокой экспрессией, которые никогда не были связаны с лейкемией в целом и острым Т-клеточным лейкозом у детей в частности. Шестью выбранными lncRNA с повышенным уровнем экспрессии являются: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG00000233410), AC116351.1 (ENSG00000215246). ), AC247036.1 (ENSG00000271201). Используя наши и другие общедоступные наборы данных экспериментов по секвенированию РНК, мы подтвердим наши предположения in silico, а затем приступим к последующим анализам биологических образцов. Уровни экспрессии этих lncRNAs будут проанализированы ex vivo с использованием экспериментов RT-PCR в выбранной группе по сравнению с PBMC, полученными от здоровых субъектов и детей, больных острым лимфобластным лейкозом B-клеток (B-ALL) (уже присутствующих в наших исследованиях). Биобанк) для установления сверхэкспрессии в популяции T-ALL и ее специфичности по отношению к другому педиатрическому гематологическому заболеванию, такому как B-ALL. Более того, уровни транскриптов выбранных днРНК будут проанализированы как минимум на 5 модельных клеточных линиях как для T-ALL, так и для B-ALL. Эти данные позволят нам выбрать лучшие клеточные модели для последующих функциональных исследований. Данные об экспрессии днРНК будут сопоставлены с клиническими данными педиатрических пациентов с Т-ОЛЛ, чтобы выявить корреляцию между экспрессией днРНК и результатами лечения пациентов, а также получить молекулярную подпись днРНК, специфичную для Т-ОЛЛ, которая будет полезна. для диагностики и улучшения ведения педиатрических пациентов.

Конкретная цель 2. Идентификация цис-регуляторных элементов, дифференциально доступных между педиатрическими пациентами с Т-ОЛЛ и здоровыми субъектами, оценка эпигенетических модификаций локусов, идентифицированных выше, и моделирование генных регуляторных сетей для выяснения функциональной роли кандидатных днРНК в детском Т-ОЛЛ. Текущие достижения в области высокопроизводительного секвенирования и биоинформатических подходов показали, что днРНК могут регулировать экспрессию генов на эпигенетическом, транскрипционном и посттранскрипционном уровнях. Что касается эпигенетической стороны, они могут вызывать значительные изменения в архитектуре хроматина, метилировании ДНК и модификациях гистонов. Например, днРНК могут направлять регуляторы транскрипции к определенным геномным локусам или облегчать связь энхансер-промотор, осуществляя прямое или непрямое ремоделирование сворачивания хроматина. Сегодня хорошо известно, что такого рода механизмы эпигенетической регуляции оказывают решающее влияние на различные стадии возникновения и прогрессирования злокачественных новообразований, от неконтролируемой пролиферации до устойчивости к апоптозу, изменяя доступность хроматина и состояние метилирования цис-регуляторных элементов и, следовательно, приводя к аберрантным генам. экспрессия в опухолях по сравнению со здоровым аналогом. Несмотря на то, что эпигенетические изменения, как известно, также являются ключевым фактором при лейкозе, были достигнуты незначительные успехи в выяснении ключевой роли днРНК в эпигеномном ландшафте ВСЕХ пациентов, не говоря уже о педиатрических больных. Идентифицировано лишь несколько специфических днРНК, и большинство вопросов об их регуляторной функции как потенциальных онкогенов или опухолевых супрессоров остаются без ответа и даже не заданными. Для цели 2 мы раскроем регуляторную динамику взаимодействия днРНК, эпигенетических факторов и экспрессии онкогенов. Мы планируем объединить эксперименты RNA-seq с ATAC-seq и MmethylC-seq в образцах педиатрических пациентов T-ALL в сравнении с наивными Т-клетками из пуповинной крови. ATAC-seq захватывает открытые области хроматина, обычно триметилированные по H3K4, H3K36 и H3K79, которые обычно коррелируют с цис-регуляторными элементами. ATACseq образцов T-ALL обеспечит геномные области, представляющие интерес для прогнозирования предполагаемых участков связывания ДНК с геномом днРНК с помощью вычислительных методов, а в сочетании с транскриптомикой и функциональным анализом эта технология позволит нам биоинформатически моделировать динамические взаимодействия между геномными цис-регуляторными элементы и транс-эффекторы, такие как факторы транскрипции, комплексы ремоделирования хроматина и днРНК. Кроме того, поскольку новые данные выявили перекрестные помехи также между днРНК и метилированием ДНК, мы проведем полногеномную идентификацию состояний метилирования цитозиновой ДНК с одноосновным разрешением с помощью метода MmethylC-seq, чтобы дополнить и улучшить нашу модель сети регуляции генов. . После того, как эпигенетический ландшафт пациентов с Т-ОЛЛ будет определен, мы намерены также охарактеризовать хроматин и транскриптомный ландшафт в моделях клеточной линии Т-ОЛЛ, как в контрольных условиях, так и после нокдауна целевых днРНК (более подробную информацию см. в разделе Цель 3). . Этот эксперимент поможет нам подтвердить и уточнить нашу модель механизма действия исследуемых днРНК. Эта перекрестная стратегия функциональных экспериментов и вычислительных моделей обеспечит механистическое понимание эпигенетических и транскриптомных отношений при педиатрическом TALL и, прежде всего, проложит путь к новым стратегиям диагностического и терапевтического вмешательства.

Конкретная цель 3. Оценка с использованием соответствующих модельных систем клеточных линий T-ALL роли идентифицированных днРНК в модификациях эпигенома.

Оценив эпигеном пациентов с Т-ОЛЛ по сравнению со здоровыми людьми, мы перейдем к оценке участия идентифицированных днРНК в лейкемогенезе. Деятельность Aim3 будет осуществляться в сотрудничестве с UO3, у которого есть все инструменты и навыки для поддержки этого экспериментального этапа. Мы перейдем к временному молчанию идентифицированных днРНК в модельных клеточных линиях T-ALL, которые экспрессируют их на самых высоких уровнях. Для экспериментов по подавлению мы будем использовать традиционные (липофектамин или лентивирусные векторы) или инновационные методы. В частности, недавно разработанный американской компанией (FANA-ASO, олигонуклеотид, AUMBiotech, США) метод основан на использовании модифицированных олигонуклеотидов, способных проникать в кроветворные клетки без применения трансфекционных агентов, известных своей токсичностью для клеток. FANA-ASO — это технология, широко используемая для подавления целевых транскриптов в моделях кроветворения, которые трудно трансфецировать с использованием классических методов трансфекции. Они также обеспечивают высокую эффективность подавления таких молекул, как днРНК.

В выбранных модельных системах T-ALL каждая днРНК будет молчать индивидуально. После временной трансфекции эффективность молчания будет проверена с помощью q-RT-PCR в разные моменты времени. Затем мы предлагаем проанализировать влияние нокдауна днРНК на прогрессирование опухоли путем оценки изменений в биологическом поведении трансфицированных клеток (т.е.

пролиферация, прогрессирование клеточного цикла и способность к подвижности), изменения фенотипа клеток (путем проведения трехмерного культурального анализа), эпителиально-мезенхимального перехода (ЕМТ), маркеров стволовых клеток, окислительного стресса и чувствительности к лекарственным средствам (путем проведения анализа жизнеспособности или IC50). расчет). В зависимости от полученных результатов будут также рассмотрены совмещенные эксперименты по сайленсингу с двумя днРНК одновременно. Для днРНК, которые окажут наибольшее влияние на выбранные модели, мы оценим, какое влияние днРНК оказывают на реорганизацию хроматина, посредством применения методов NGS, описанных в цели 2, сравнивая молчащие модели днРНК по отношению к необработанному контролю. . Эти данные позволят нам оценить взаимосвязь между уровнями экспрессии идентифицированных днРНК и своеобразными изменениями хроматина в лейкозных Т-клетках. Эти эксперименты побудили нас идентифицировать конкретную генную регуляторную сеть, связанную с выбранными днРНК. Перейдя от лабораторного стола к койкам пациентов, мы заглушим выбранные днРНК непосредственно в детских Т-бластах и ​​оценим изменения в уровнях гена, идентифицированного как часть генной регуляторной сети выбранной днРНК.

Выявленные изменения затем можно было бы соотнести с клиническими особенностями заболевания, чтобы оценить их влияние на терапевтический ответ.