RNAs não codificantes longos e seu papel no epigenoma como marcadores de diagnóstico na leucemia linfoblástica aguda infantil de células T.

Objetivo Específico 1 Avaliação de lncRNAs em uma coorte de pacientes com LLA-T em comparação com linfócitos T-Naive e PBMC de indivíduos saudáveis. Identificação dos modelos in vitro mais adequados. Para atingir o objetivo do Objetivo 1, planejamos inscrever uma coorte de pacientes pediátricos afetados por LLA-T no hospital Pausilipon, o UO2, que é um centro de referência para o tratamento de doenças oncológicas na Campânia. Para o recrutamento de pacientes, será utilizado o consentimento informado específico e detalhado de acordo com o atual Regulamento Geral de Proteção de Dados. As amostras biológicas coletadas e processadas serão armazenadas no SDN Biobank, que é o biobanco institucional do IRCCS Synlab SDN e é membro da infraestrutura BBMRI-ERIC. Considerando que LLA-T infantil é um câncer raro, com incidência na população pediátrica de 1 caso a cada 100.000 crianças, planejamos inscrever 16-20 pacientes com LLA-T. A partir de dados de RNA-seq obtidos anteriormente por nosso laboratório, comparando 6 LLA-T pediátricas com células T virgens derivadas de sangue do cordão umbilical, identificamos um conjunto de lncRNAs regulados diferencialmente. Destes, selecionamos 6 entre os lncRNAs mais regulados positivamente que nunca foram associados à leucemia, em geral, e à leucemia aguda pediátrica de células T em particular. Os 6 lncRNAs selecionados regulados positivamente são: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG00000233410), AC116351.1 (ENSG00000215246), AC247036.1 (ENSG00000271201). Usando os nossos e outros conjuntos de dados públicos de experimentos de RNA-seq, confirmaremos nossas sugestões in silico e, em seguida, procederemos às análises subsequentes em amostras biológicas. Os níveis de expressão desses lncRNAs serão analisados ​​ex vivo, usando experimentos de RT-PCR, na coorte selecionada em comparação com PBMCs derivadas de indivíduos saudáveis ​​e pacientes pediátricos com Leucemia Linfoblástica Aguda de Células B (B-ALL) (já presentes em nosso Biobank) para verificar a superexpressão na população LLA-T e a especificidade em relação a outra doença hematológica pediátrica, como LLA-B. Além disso, os níveis de transcrição dos lncRNAs selecionados serão analisados ​​em um mínimo de 5 linhas celulares da doença modelo, tanto para T-ALL quanto para B-ALL. Estes dados nos permitirão selecionar os melhores modelos celulares para estudos funcionais posteriores. Os dados de expressão de lncRNA serão cruzados com dados clínicos de indivíduos pediátricos T-ALL, a fim de identificar uma correlação entre a expressão dos lncRNAs e os resultados dos pacientes e para obter uma assinatura molecular de lncRNAs específica para T-ALL que será útil para o diagnóstico e para a melhoria do manejo do paciente pediátrico.

Objetivo Específico 2 Identificação de elementos reguladores cis diferencialmente acessíveis entre pacientes pediátricos com LLA-T e indivíduos saudáveis, avaliação de modificações epigenéticas dos loci identificados acima e modelagem de redes reguladoras de genes para desvendar o papel funcional de lncRNAs candidatos na LLA-T infantil. Os avanços atuais no sequenciamento de alto rendimento e nas abordagens de bioinformática destacaram que os lncRNAs podem regular a expressão gênica nos níveis epigenético, transcricional e pós-transcricional. Quanto ao lado epigenético, eles podem provocar mudanças significativas na arquitetura da cromatina, metilação do DNA e modificações nas histonas. Por exemplo, os lncRNAs podem guiar os reguladores transcricionais para loci genômicos específicos ou facilitar a comunicação intensificador-promotor operando uma remodelação direta ou indireta do dobramento da cromatina. Hoje é bem conhecido que estes tipos de mecanismos de regulação epigenética têm um impacto crítico em diferentes etapas do início e progressão da malignidade, desde a proliferação descontrolada até à resistência à apoptose, alterando a acessibilidade da cromatina e o estado de metilação dos elementos reguladores cis e, portanto, levando a genes aberrantes. expressão em tumores em relação à contraparte saudável. Apesar do fato de que as alterações epigenéticas também são conhecidas por serem um fator-chave na leucemia, poucos avanços foram feitos para elucidar o papel fundamental dos lncRNAs no cenário epigenômico dos pacientes com LLA, e muito menos dos pediátricos. Apenas alguns lncRNAs específicos foram identificados e a maioria das questões sobre a sua função reguladora como potenciais oncogenes ou supressores de tumor permanecem sem resposta e até mesmo sem resposta. Para o Objetivo 2, iremos desvendar a dinâmica regulatória interagindo entre lncRNAs, fatores epigenéticos e expressão de oncogenes. Planejamos acoplar experimentos de RNA-seq com ATAC-seq e MethylC-seq em amostras de pacientes pediátricos T-ALL em comparação com células T virgens do sangue do cordão umbilical. ATAC-seq captura regiões abertas da cromatina, geralmente trimetiladas em H3K4, H3K36 e H3K79, que normalmente se correlacionam com elementos reguladores cis. ATACseq de amostras de T-ALL fornecerá regiões genômicas de interesse para prever locais putativos de ligação ao DNA do genoma do lncRNA por meio de métodos computacionais e, em combinação com transcriptômica e análises funcionais, esta tecnologia nos permitirá modelar bioinformaticamente as interações dinâmicas entre cis-reguladores genômicos elementos e transefetores, como fatores de transcrição, complexos de remodelação da cromatina e lncRNAs. Além disso, como evidências emergentes revelaram um crosstalk também entre lncRNAs e metilação do DNA, realizaremos uma identificação em todo o genoma dos estados de metilação do DNA da citosina em resolução de base única através da técnica MethylC-seq, a fim de complementar e aprimorar nosso modelo de rede reguladora genética . Uma vez definidas as paisagens epigenéticas dos pacientes com LLA-T, pretendemos caracterizar também a cromatina e a paisagem transcriptômica em modelos de linhagem celular de LLA-T, tanto em condições de controle quanto após o knockdown dos lncRNAs alvo (ver Aim3 para mais detalhes) . Este experimento nos ajudaria a corroborar e aprimorar nosso modelo do mecanismo operacional dos lncRNAs sob investigação. Esta estratégia cruzada de experimentos funcionais e modelos computacionais fornecerá uma compreensão mecanicista das relações epigenéticas e transcriptômicas em TALL pediátrico e, acima de tudo, abrirá caminho para novas estratégias de intervenção diagnóstica e terapêutica.

Objetivo Específico 3 Avaliação, utilizando sistemas modelo de linha celular T-ALL apropriados, do papel dos lncRNAs identificados nas modificações do epigenoma.

Uma vez avaliado o epigenoma de pacientes com LLA-T em comparação com indivíduos saudáveis, procederemos à avaliação do envolvimento de lncRNAs identificados na leucemogênese. As atividades do Aim3 serão realizadas em colaboração com a UO3, que possui todas as ferramentas e competências para apoiar esta fase experimental. Procederemos ao silenciamento transitório dos lncRNAs identificados, nas linhas celulares modelo T-ALL que os expressam nos níveis mais elevados. Para os experimentos de silenciamento utilizaremos métodos tradicionais (lipofectamina ou vetores lentivirais) ou inovadores. Em particular, um método recentemente desenvolvido por uma empresa americana (FANA-ASO, oligonucleótido, AUMBiotech, EUA) baseado na utilização de oligonucleótidos modificados capazes de entrar em células hematopoiéticas sem a utilização de agentes de transfecção, conhecidos por serem tóxicos para as células. O FANA-ASO é uma tecnologia abundantemente utilizada para o silenciamento de transcritos alvo em modelos hematopoiéticos que são difíceis de transfectar utilizando métodos clássicos de transfecção. Eles também fornecem alta eficiência de silenciamento para moléculas como os lncRNAs.

Nos sistemas modelo T-ALL selecionados, cada lncRNA será silenciado individualmente. Após a transfecção transitória, a eficiência do silenciamento será verificada por q-RT-PCR em diferentes momentos. Então, propomos analisar os efeitos do knockdown de lncRNA na progressão tumoral, avaliando mudanças nos comportamentos biológicos das células transfectadas (ou seja,

proliferação, progressão do ciclo celular e habilidades de motilidade), mudanças no fenótipo celular (realizando ensaio de cultura tridimensional), transição epitelial-mesenquimal (EMT), marcadores de células-tronco, estresse oxidativo e sensibilidade a drogas (realizando ensaio de viabilidade ou IC50 Cálculo). Dependendo dos resultados obtidos, também serão considerados experimentos de silenciamento acoplado com dois lncRNAs simultaneamente. Para os lncRNAs que terão tido maior efeito nos modelos selecionados, avaliaremos quais são os efeitos que os lncRNAs têm na reorganização da cromatina, através da aplicação dos métodos NGS relatados no Objetivo 2, comparando modelos de lncRNA silenciados em relação ao controle não tratado . Esses dados nos permitirão avaliar as relações entre os níveis de expressão dos lncRNAs identificados e alterações peculiares da cromatina nas células T leucêmicas. Estas experiências levaram-nos a identificar uma rede reguladora genética específica associada aos lncRNAs selecionados. Passando da bancada do laboratório para os leitos dos pacientes, silenciaremos os lncRNAs selecionados diretamente nos T-Blasts infantis e avaliaremos as variações nos níveis do gene identificado como parte da rede reguladora gênica do lncRNA selecionado.

As alterações identificadas poderiam então ser correlacionadas com as características clínicas da doença, a fim de avaliar o seu impacto na resposta terapêutica.