Pitkät ei-koodaavat RNA:t ja niiden rooli epigenomissa diagnostisina markkereina T-solujen akuutissa lymfoblastisessa leukemiassa.

Erityinen tavoite 1 LncRNA:iden arviointi T-ALL-potilaiden kohortissa verrattuna terveiden koehenkilöiden T-Naive-lymfosyytteihin ja PBMC-soluihin. Parhaiden sopivien in vitro -mallien tunnistaminen. Tavoitteen 1 tavoitteen saavuttamiseksi suunnittelimme rekisteröivänsä T-ALL:sta kärsiviä lapsipotilaita Pausiliponin sairaalaan, UO2:een, joka on Campanian onkologisten sairauksien hoidon referenssikeskus. Potilaiden rekrytointiin käytetään erityistä ja yksityiskohtaista tietoon perustuvaa suostumusta voimassa olevan yleisen tietosuoja-asetuksen mukaisesti. Kerätyt ja käsitellyt biologiset näytteet säilytetään SDN Biobankissa, joka on IRCCS Synlab SDN:n institutionaalinen biopankki ja BBMRI-ERIC-infrastruktuurin jäsen. Koska lapsuuden T-ALL on harvinainen syöpä, jonka ilmaantuvuus lapsiväestössä on 1 tapaus 100 000 lasta kohden, aiomme ottaa mukaan 16–20 T-ALL-potilasta. Lähtien laboratoriomme aiemmin saamista RNA-seq-tiedoista ja vertaamalla 6 lasten T-ALL:a naiiveihin napanuoraverestä peräisin oleviin T-soluihin, tunnistimme joukon eri tavalla säädeltyjä lncRNA:ita. Näistä valitsimme kuusi eniten säädeltyä lncRNA:ta, joita ei ole koskaan liitetty leukemiaan yleensä ja erityisesti lasten akuuttiin T-soluleukemiaan. Kuusi ylöspäin säädeltyä valittua lncRNA:ta ovat: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG01222 (ENSG01222) (ENSG01222 (ENSG01222) (ENSG01222 (ENSG0340102) 0215246), AC247036.1 (ENSG00000271201). Käyttämällä omia ja muita julkisia RNA-seq-kokeiden tietojoukkoja vahvistamme ehdotuksemme in silico ja jatkamme sitten biologisten näytteiden myöhempään analyysiin. Näiden lncRNA:iden ilmentymistasot analysoidaan ex vivo käyttäen RT-PCR-kokeita valitussa kohortissa verrattuna PBMC-soluihin, jotka on saatu terveiltä koehenkilöiltä ja lasten akuutti lymfoblastinen B-soluleukemia (B-ALL) -potilailta (joita esiintyy jo meillä. Biobank) varmistaakseen yli-ilmentymisen T-ALL-populaatiossa ja spesifisyyden suhteessa toiseen lasten hematologiseen sairauteen, kuten B-ALL. Lisäksi valittujen lncRNA:iden transkriptitasot analysoidaan vähintään 5 solulinjan mallisairaudessa sekä T-ALL:n että B-ALL:n osalta. Näiden tietojen avulla voimme valita parhaat solumallit myöhempiä toiminnallisia tutkimuksia varten. LncRNA-ilmentymistietoihin viitataan T-ALL-lapsipotilaiden kliinisten tietojen kanssa, jotta voidaan tunnistaa korrelaatio lncRNA:iden ilmentymisen ja potilastulosten välillä ja saada T-ALL:lle spesifisten lncRNA-molekyylien molekulaarinen allekirjoitus, joka on hyödyllinen. diagnosointiin ja lapsipotilaiden hoidon parantamiseen.

Erityinen tavoite 2: cis-säätelyelementtien tunnistaminen, jotka ovat eri tavalla saatavilla lapsi-T-ALL-potilaiden ja terveiden koehenkilöiden välillä, edellä tunnistettujen lokusten epigeneettisten modifikaatioiden arviointi ja geenisäätelyverkostojen mallintaminen lncRNA-ehdokkaiden toiminnallisen roolin selvittämiseksi lapsuuden T-ALL:ssa. Nykyiset edistysaskeleet korkean suorituskyvyn sekvensoinnissa ja bioinformaattisissa lähestymistavoissa korostivat, että lncRNA: t voivat säädellä geenien ilmentymistä epigeneettisellä, transkription ja transkription jälkeisellä tasolla. Mitä tulee epigeneettiseen puoleen, ne voivat aiheuttaa merkittäviä muutoksia kromatiinin arkkitehtuurissa, DNA:n metylaatiossa ja histonien modifikaatioissa. Esimerkiksi lncRNA:t voivat ohjata transkription säätelijät spesifisiin genomiseen lokuksiin tai helpottaa tehostaja-promoottori-kommunikaatiota suorittamalla kromatiinin laskostumisen suoraa tai epäsuoraa uudelleenmuotoilua. Nykyään tiedetään hyvin, että tällaiset epigeneettiset säätelymekanismit vaikuttavat kriittisesti pahanlaatuisten kasvainten puhkeamisen ja etenemisen eri vaiheisiin hallitsemattomasta proliferaatiosta apoptoosiresistenssiin, mikä muuttaa kromatiinin saatavuutta ja cis-säätelyelementtien metylaatiotilaa ja johtaa siten poikkeavaan geeniin. ilmentymistä kasvaimissa suhteessa terveeseen vastineeseen. Huolimatta siitä, että epigeneettisten muutosten tiedetään olevan avaintekijä myös leukemiassa, lncRNA:iden keskeisen roolin selvittämiseksi KAIKKIEN potilaiden epigenomisessa maisemassa, puhumattakaan lapsipotilaista, on tapahtunut vain vähän edistystä. Vain muutama spesifinen lncRNA:ta on tunnistettu, ja useimmat kysymykset niiden säätelytoiminnasta mahdollisina onkogeeneinä tai kasvainsuppressoreina jäävät vastaamatta ja jopa kysymättä. Tavoitteen 2 osalta paljastamme lncRNA:iden, epigeneettisten tekijöiden ja onkogeenin ilmentymisen välisen säätelydynamiikan. Aiomme yhdistää RNA-seq:n ATAC-seq- ja MethylC-seq-kokeisiin T-ALL-lapsipotilasnäytteissä verrattuna napanuoraveren naiiveihin T-soluihin. ATAC-seq sieppaa avoimia kromatiinialueita, jotka yleensä trimetyloidaan H3K4:ssä, H3K36:ssa ja H3K79:ssä, jotka tyypillisesti korreloivat cis-säätelyelementtien kanssa. T-ALL-näytteiden ATACseq tarjoaa kiinnostavia genomialueita ennustamaan oletettuja lncRNA-genomin DNA:n sitoutumiskohtia laskennallisilla menetelmillä, ja yhdessä transkriptomiikan ja funktionaalisten analyysien kanssa tämä teknologia antaa meille mahdollisuuden mallintaa bioinformaattisesti genomisen cis-säätelyn välisiä dynaamisia vuorovaikutuksia. elementit ja trans-efektorit, kuten transkriptiotekijät, kromatiinin uudelleenmuotoilukompleksit ja lncRNA:t. Lisäksi, koska uudet todisteet ovat paljastaneet ylikuulumisen myös lncRNA:iden ja DNA:n metylaation välillä, suoritamme sytosiinin DNA:n metylaatiotilojen genomin laajuisen tunnistamisen yhden emäksen resoluutiolla MethylC-seq-tekniikalla täydentääksemme ja parantaaksemme geenisäätelyverkostomalliamme. . Kun T-ALL-potilaiden epigeneettiset maisemat on määritelty, aiomme karakterisoida myös kromatiini- ja transkriptiomaiseman T-ALL-solulinjamalleissa sekä kontrolliolosuhteissa että kohde-lncRNA:iden kaatuessa (lisätietoja on kohdassa Tavoite 3). . Tämä koe auttaisi meitä vahvistamaan ja terävöittämään malliamme tutkittavien lncRNA:iden toimintamekanismista. Tämä toiminnallisten kokeiden ja laskennallisten mallien ristikkäinen strategia tarjoaa mekaanisen ymmärryksen epigeneettisistä ja transkriptomisista suhteista lasten TALL:ssa ja ennen kaikkea tasoittaa tietä uusille diagnostisten ja terapeuttisten interventioiden strategioihin.

Erityinen tavoite 3 Arviointi käyttäen sopivia T-ALL-solulinjamallijärjestelmiä tunnistettujen lncRNA:iden roolista epigenomimodifikaatioissa.

Kun T-ALL-potilaiden epigenomi on arvioitu verrattuna terveisiin koehenkilöihin, jatkamme tunnistettujen lncRNA:iden osallistumisen arvioimiseen leukemogeneesissä. Aim3:n toiminta toteutetaan yhteistyössä UO3:n kanssa, jolla on kaikki työkalut ja taidot tukea tätä kokeiluvaihetta. Jatkamme tunnistettujen lncRNA:iden ohimenevää hiljentämistä T-ALL-mallisolulinjoissa, jotka ilmentävät niitä korkeimmalla tasolla. Vaimennuskokeissa käytämme perinteisiä (lipofektamiini- tai lentivirusvektorit) tai innovatiivisia menetelmiä. Erityisesti amerikkalaisen yrityksen (FANA-ASO, oligonukleotidi, AUMBiotech, USA) äskettäin kehittämä menetelmä, joka perustuu modifioitujen oligonukleotidien käyttöön, jotka pystyvät pääsemään hematopoieettisiin soluihin ilman transfektioaineiden käyttöä, joiden tiedetään olevan myrkyllisiä soluille. FANA-ASO on tekniikka, jota käytetään runsaasti kohdetranskriptien hiljentämiseen hematopoieettisissa malleissa, joita on vaikea transfektoida klassisilla transfektiomenetelmillä. Ne tarjoavat myös korkean hiljennystehokkuuden molekyyleille, kuten lncRNA:ille.

Valituissa T-ALL-mallijärjestelmissä jokainen lncRNA hiljennetään yksitellen. Ohimenevän transfektion jälkeen vaimennuksen tehokkuus varmistetaan q-RT-PCR:llä eri ajankohtina. Tämän jälkeen ehdotamme lncRNA:n knockdownin vaikutusten analysointia kasvaimen etenemiseen arvioimalla muutoksia transfektoitujen solujen biologisessa käyttäytymisessä (ts.

proliferaatio, solusyklin eteneminen ja liikkuvuuskyvyt), muutokset solun fenotyypissä (suorittamalla kolmiulotteinen viljelymääritys), epiteeli-mesenkymaalinen siirtymä (EMT), kantasolumarkkerit, oksidatiivinen stressi ja lääkeherkkyys (suorittamalla elinkelpoisuusmääritys tai IC50 laskeminen). Saaduista tuloksista riippuen harkitaan myös kytkettyjä vaimennuskokeita kahdella lncRNA:lla samanaikaisesti. Niiden lncRNA:iden osalta, joilla on ollut suurin vaikutus valittuihin malleihin, arvioimme, mitkä ovat lncRNA:iden vaikutukset kromatiinin uudelleenjärjestelyyn, käyttämällä tavoitteessa 2 raportoituja NGS-menetelmiä, vertaamalla vaimennettuja lncRNA-malleja käsittelemättömään kontrolliin. . Nämä tiedot antavat meille mahdollisuuden arvioida suhteita tunnistettujen lncRNA:iden ilmentymistasojen ja erityisten kromatiinimuutosten välillä leukeemisissa T-soluissa. Nämä kokeet saivat meidät tunnistamaan spesifisen geenisäätelyverkoston, joka liittyy valittuihin lncRNA: hin. Laboratoriopenkiltä potilassänkyihin siirtyessä hiljennämme valitut lncRNA:t suoraan lapsuuden T-Blasteissa ja arvioimme osaksi valitun lncRNA:n geenisäätelyverkostoa tunnistetun geenin tasojen vaihtelua.

Tunnistetut muutokset voitaisiin sitten korreloida sairauden kliinisten piirteiden kanssa, jotta voidaan arvioida niiden vaikutus terapeuttiseen vasteeseen.