Lange ikke-kodende RNA-er og deres rolle på epigenom som diagnostiske markører ved akutt lymfoblastisk leukemi hos barn hos T-celler.

Spesifikt mål 1 Evaluering av lncRNA-er i en kohort av T-ALL-pasienter sammenlignet med T-naive lymfocytter og PBMC fra friske forsøkspersoner. Identifikasjon av de best egnede in vitro-modellene. For å nå målet med mål 1 planla vi å registrere en kohort av pediatriske pasienter rammet av T-ALL ved Pausilipon sykehuset, UO2, som er et referansesenter for behandling av onkologiske sykdommer i Campania. For pasientrekruttering vil spesifikt og detaljert informert samtykke bli brukt i henhold til gjeldende personvernforordning. De innsamlede og behandlede biologiske prøvene vil bli lagret i SDN Biobank, som er den institusjonelle biobanken til IRCCS Synlab SDN og er medlem av BBMRI-ERIC-infrastrukturen. Tatt i betraktning at barndoms T-ALL er sjelden kreft, med en forekomst i den pediatriske populasjonen på 1 tilfelle hvert 100 000 barn, planlegger vi å registrere 16-20 T-ALL pasienter. Med utgangspunkt i RNA-seq-data tidligere innhentet av laboratoriet vårt, og sammenlignet 6 pediatriske T-ALL med naive T-celler avledet fra navlestrengsblod, identifiserte vi et sett med differensielt regulerte lncRNA. Fra disse valgte vi 6 blant de mest oppregulerte lncRNA-ene som aldri har vært assosiert med leukemi, generelt, og pediatrisk akutt T-celleleukemi spesielt. De 6 oppregulerte utvalgte lncRNA-ene er: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG0041001.30106102010101010101010101010101010101010010010101001010010100101001001010010010100101001. 6), AC247036.1 (ENSG00000271201). Ved å bruke vårt og andre offentlige datasett med RNA-seq-eksperimenter, vil vi bekrefte forslagene våre i silico, og deretter fortsette til påfølgende analyser på biologiske prøver. Ekspresjonsnivåene til disse lncRNA-ene vil bli analysert ex vivo, ved bruk av RT-PCR-eksperimenter, i den valgte kohorten sammenlignet med PBMC-er avledet fra friske forsøkspersoner og pediatriske akutt lymfoblastisk leukemi av B-celle (B-ALL) pasienter (allerede til stede i vår Biobank) for å fastslå overekspresjon i T-ALL-populasjonen og spesifisitet med hensyn til en annen pediatrisk hematologisk sykdom som B-ALL. Videre vil transkripsjonsnivåene til de utvalgte lncRNA-ene bli analysert i minimum 5 cellelinjer modellsykdom, for både T-ALL og B-ALL. Disse dataene vil tillate oss å velge de beste cellulære modellene for påfølgende funksjonelle studier. LncRNA-ekspresjonsdataene vil bli kryssreferert med kliniske data fra T-ALL pediatriske forsøkspersoner for å identifisere en korrelasjon mellom uttrykket av lncRNA-ene og pasientresultater og for å oppnå en molekylær signatur av lncRNA-er spesifikke for T-ALL som vil være nyttig for diagnostisering og for forbedring av pediatrisk pasientbehandling.

Spesifikt mål 2 Identifikasjon av cis-regulatoriske elementer som er differensielt tilgjengelige mellom pediatriske T-ALL-pasienter og friske forsøkspersoner, evaluering av epigenetiske modifikasjoner av lokiene identifisert ovenfor, og genregulerende nettverk som modellerer for å avdekke den funksjonelle rollen til kandidat-lncRNA-er i barndoms T-ALL. Nåværende fremskritt innen sekvensering med høy gjennomstrømning og bioinformatiske tilnærminger fremhevet at lncRNA-er kan regulere genuttrykk på epigenetiske, transkripsjonelle og post-transkripsjonelle nivåer. Når det gjelder den epigenetiske siden, kan de drive betydelige endringer i kromatinarkitektur, DNA-metylering og histonmodifikasjoner. For eksempel kan lncRNA-er lede transkripsjonsregulatorer til spesifikke genomiske loki eller lette forsterker-promoter-kommunikasjonen ved å drive en direkte eller indirekte ombygging av kromatinfoldingen. I dag er det velkjent at denne typen epigenetiske reguleringsmekanismer har en kritisk innvirkning på ulike trinn i malignitetsutbrudd og progresjon, fra ukontrollert spredning til apoptoseresistens, endrer kromatintilgjengeligheten og metyleringstilstanden til cis-regulerende elementer og fører derfor til avvikende gen. uttrykk i svulster med hensyn til den friske motparten. Til tross for at epigenetiske endringer også er kjent for å være en nøkkelfaktor i leukemi, har det blitt gjort knappe fremskritt for å belyse den sentrale rollen til lncRNA i det epigenomiske landskapet til ALLE pasienter, enn si pediatriske. Bare få spesifikke lncRNA-er har blitt identifisert, og de fleste spørsmålene om deres regulatoriske funksjon som potensielle onkogener eller tumor-suppressorer forblir ubesvarte og til og med ubesvarte. For mål 2 vil vi avsløre den regulatoriske dynamikken som spiller mellom lncRNA, epigenetiske faktorer og onkogenekspresjon. Vi planlegger å koble RNA-seq med ATAC-seq og MethylC-seq eksperimenter i T-ALL pediatriske pasientprøver sammenlignet med naive T-celler fra navlestrengsblod. ATAC-seq fanger opp åpne kromatinregioner, vanligvis trimetylert ved H3K4, H3K36 og H3K79, som vanligvis korrelerer med cis-regulatoriske elementer. ATACseq av T-ALL-prøver vil gi genomiske områder av interesse for å forutsi antatte lncRNA-genom-DNA-bindingssteder via beregningsmetoder, og i kombinasjon med transkriptomikk og funksjonelle analyser vil denne teknologien tillate oss å bioinformatisk modellere de dynamiske interaksjonene mellom genomisk cis-regulatorisk elementer og trans-effektorer som transkripsjonsfaktorer, kromatinremodelleringskomplekser og lncRNA. Videre, ettersom nye bevis har avdekket en krysstale også mellom lncRNA og DNA-metylering, vil vi utføre en genomomfattende identifikasjon av cytosin-DNA-metyleringstilstander ved enkeltbaseoppløsning gjennom MethylC-seq-teknikk for å komplementere og forbedre vår genregulerende nettverksmodell . Når de epigenetiske landskapene til T-ALL-pasienter er definert, har vi til hensikt å karakterisere også kromatin- og transkriptomisk landskap i T-ALL-cellelinjemodeller, både under kontrollforhold og ved knockdown av mål-lncRNA-ene (se Aim3 for ytterligere detaljer) . Dette eksperimentet vil hjelpe oss med å bekrefte og skjerpe modellen vår av driftsmekanismen for lncRNA-er som undersøkes. Denne kryssende strategien for funksjonelle eksperimenter og beregningsmodeller vil gi mekanistisk forståelse av epigenetiske og transkriptomiske relasjoner i pediatrisk TALL, og fremfor alt vil bane vei for nye strategier for diagnostisk og terapeutisk intervensjon.

Spesifikt mål 3 Evaluering, ved bruk av passende T-ALL-cellelinjemodellsystemer, av rollen til identifiserte lncRNA-er på epigenommodifikasjoner.

Når vi har evaluert epigenomet til T-ALL-pasienter sammenlignet med friske forsøkspersoner, vil vi fortsette å vurdere involveringen av identifiserte lncRNA-er i leukemogenese. Aktivitetene til Aim3 vil bli gjennomført i samarbeid med UO3, som har alle verktøy og ferdigheter til å støtte denne eksperimentelle fasen. Vi vil fortsette til forbigående lyddemping av identifiserte lncRNA-er, i T-ALL-modellcellelinjene som uttrykker dem på de høyeste nivåene. For dempingseksperimentene vil vi bruke tradisjonelle (lipofektamin eller lentivirale vektorer) eller innovative metoder. Spesielt en metode som nylig er utviklet av et amerikansk selskap (FANA-ASO, oligonukleotid, AUMBiotech, USA) basert på bruk av modifiserte oligonukleotider som kan gå inn i hematopoietiske celler uten bruk av transfeksjonsmidler, kjent for å være giftige for celler. FANA-ASO er en teknologi som brukes rikelig for å dempe måltranskripsjoner i hematopoietiske modeller som er vanskelige å transfisere ved bruk av klassiske transfeksjonsmetoder. De gir også høy lyddempingseffektivitet for molekyler som lncRNA.

I de valgte T-ALL-modellsystemene vil hvert lncRNA lydstilles individuelt. Etter den forbigående transfeksjonen vil effektiviteten av lyddempingen bli verifisert av q-RT-PCR på forskjellige tidspunkter. Deretter foreslår vi å analysere effekten av lncRNA knockdown på tumorprogresjon ved å evaluere endringer i biologisk oppførsel til de transfekterte cellene (dvs.

proliferasjon, cellesyklusprogresjon og bevegelighetsevner), endringer i cellefenotype (ved å utføre tredimensjonal kulturanalyse), epitel-mesenkymal overgang (EMT), stamcellemarkører, oksidativt stress og medikamentfølsomhet (ved å utføre levedyktighetsanalyse eller IC50) beregning). Avhengig av de oppnådde resultatene, vil koblede lyddempingseksperimenter med to lncRNA-er samtidig også bli vurdert. For de lncRNA-ene som vil ha hatt størst effekt på de utvalgte modellene, vil vi evaluere hvilke effekter lncRNA-er har på kromatin-reorganisering, gjennom bruk av NGS-metodene rapportert i Mål 2, og sammenligne lncRNA-modeller som er stillede, med den ubehandlede kontrollen. . Disse dataene vil tillate oss å evaluere forholdet mellom ekspresjonsnivåene til identifiserte lncRNA-er og særegne kromatinendringer i leukemiske T-celler. Disse eksperimentene fikk oss til å identifisere et spesifikt genregulerende nettverk assosiert med de utvalgte lncRNA-ene. Ved å gå fra laboratoriebenken til pasientsengene vil vi dempe de utvalgte lncRNA-ene direkte i barndommens T-blaster, og vi vil evaluere variasjonene i nivåene til genet identifisert som en del av det genregulerende nettverket til det valgte lncRNA.

De identifiserte endringene kan deretter korreleres med de kliniske egenskapene til sykdommen for å evaluere deres innvirkning på terapeutisk respons.