Hosszú, nem kódoló RNS-ek és szerepük az epigenomban, mint diagnosztikai markerek a T-sejtek gyermekkori akut limfoblasztos leukémiájában.

1. specifikus cél Az lncRNS-ek értékelése T-ALL betegek kohorszában, összehasonlítva az egészséges alanyokból származó T-naiv limfocitákkal és PBMC-vel. A legalkalmasabb in vitro modellek azonosítása. Az 1. cél elérése érdekében a T-ALL-ben szenvedő gyermekbetegek csoportjának felvételét terveztük a pausiliponi kórházba, az UO2-be, amely a campaniai onkológiai betegségek kezelésének referenciaközpontja. A betegek toborzásához konkrét és részletes tájékoztatáson alapuló beleegyezés kerül felhasználásra a hatályos általános adatvédelmi rendelet szerint. Az összegyűjtött és feldolgozott biológiai minták az SDN Biobankban kerülnek tárolásra, amely az IRCCS Synlab SDN intézményi biobankja és a BBMRI-ERIC infrastruktúra tagja. Figyelembe véve, hogy a gyermekkori T-ALL ritka rák, a gyermekpopulációban minden 100 000 gyermekből 1 eset fordul elő, 16-20 T-ALL beteg felvételét tervezzük. A laboratóriumunk által korábban szerzett RNS-seq adatokból kiindulva, 6 gyermekkori T-ALL-t összehasonlítva köldökzsinórvérből származó naiv T-sejtekkel, differenciálisan szabályozott lncRNS-eket azonosítottunk. Ezek közül kiválasztottunk 6-ot a leginkább szabályozott lncRNS-ek közül, amelyek soha nem jártak leukémiával általában, és különösen a gyermekkori akut T-sejtes leukémiával. A 6 fokozottan szabályozott kiválasztott lncRNS a következő: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG01222 (ENSG01222) (ENSG01222 (ENSG03401002) 0215246), AC247036.1 (ENSG00000271201). A mi és az RNA-seq kísérletek más nyilvános adatkészleteinek felhasználásával in silico megerősítjük javaslatainkat, majd folytatjuk a biológiai minták további elemzését. Ezen lncRNS-ek expressziós szintjét ex vivo elemzik RT-PCR-kísérletekkel a kiválasztott kohorszban, összehasonlítva az egészséges alanyokból származó PBMC-kkel és a gyermekkori akut limfoblasztos B-sejtes leukémiás (B-ALL) betegektől (már jelen vannak a csoportunkban). Biobank) a T-ALL populáció túlzott expressziójának és egy másik gyermekkori hematológiai betegség, például a B-ALL specifikusságának megállapítására. Ezenkívül a kiválasztott lncRNS-ek transzkriptumszintjeit legalább 5 sejtvonal modellbetegségben elemzik, mind a T-ALL, mind a B-ALL esetében. Ezek az adatok lehetővé teszik számunkra, hogy kiválasszuk a legjobb sejtmodelleket a későbbi funkcionális vizsgálatokhoz. Az lncRNS-expressziós adatokat a T-ALL-es gyermekgyógyászati ​​alanyok klinikai adataival kereszthivatkozásba fogjuk vetni annak érdekében, hogy az lncRNS-ek expressziója és a betegek kimenetele közötti összefüggést azonosítsuk, és a T-ALL-re specifikus lncRNS-ek molekuláris aláírását kapjuk, ami hasznos lesz. a diagnózis felállítására és a gyermekbeteg-kezelés javítására.

2. specifikus cél A gyermekkori T-ALL-betegek és egészséges alanyok között eltérően hozzáférhető cisz-szabályozó elemek azonosítása, a fent azonosított lókuszok epigenetikai módosításainak értékelése, valamint génszabályozó hálózatok modellezése a jelölt lncRNS-ek funkcionális szerepének feltárására gyermekkori T-ALL-ben. A nagy áteresztőképességű szekvenálás és a bioinformatikai megközelítések jelenlegi fejlődése rávilágított arra, hogy az lncRNS-ek szabályozhatják a génexpressziót epigenetikai, transzkripciós és poszttranszkripciós szinten. Ami az epigenetikai oldalt illeti, jelentős változásokat idézhetnek elő a kromatin architektúrában, a DNS-metilációban és a hiszton módosulásokban. Például az lncRNS-ek a transzkripciós szabályozókat specifikus genomiális lókuszokhoz irányíthatják, vagy elősegíthetik az enhanszer-promóter kommunikációt a kromatin hajtogatásának közvetlen vagy közvetett átalakításával. Ma már jól ismert, hogy az ilyen típusú epigenetikai szabályozási mechanizmusok kritikus hatást gyakorolnak a rosszindulatú daganatok kialakulásának és progressziójának különböző lépéseire, a kontrollálatlan proliferációtól az apoptózis-rezisztenciáig, megváltoztatva a kromatin hozzáférhetőségét és a cisz-szabályozó elemek metilációs állapotát, és így aberráns génekhez vezetnek. expressziója a tumorokban az egészséges megfelelőhöz képest. Annak ellenére, hogy az epigenetikai változásokról ismert, hogy a leukémia kulcstényezője is, kevés előrelépés történt az lncRNS-ek kulcsfontosságú szerepének tisztázására az ALL betegek epigenomikus táján, nem is beszélve a gyermekgyógyászati ​​betegekről. Csak néhány specifikus lncRNS-t azonosítottak, és a legtöbb kérdés a lehetséges onkogénként vagy tumorszuppresszorként való szabályozó funkciójukkal kapcsolatban megválaszolatlan, sőt fel sem merül. A 2. cél érdekében feltárjuk az lncRNS-ek, az epigenetikai faktorok és az onkogén expressziója közötti kölcsönhatás szabályozási dinamikáját. Tervezzük az RNS-seq és az ATAC-seq és MethylC-seq párosítását T-ALL gyermekbeteg mintákban, összehasonlítva a köldökzsinórvérből származó naiv T-sejtekkel. Az ATAC-seq megragadja a nyitott kromatin régiókat, amelyek általában a H3K4, H3K36 és H3K79 helyen trimetilálódnak, amelyek jellemzően a cisz-szabályozó elemekkel korrelálnak. A T-ALL minták ATACseq-ja genomiális régiókat biztosít majd a feltételezett lncRNS-genom DNS-kötő helyek előrejelzéséhez számítási módszerekkel, és a transzkriptomikával és funkcionális elemzésekkel kombinálva ez a technológia lehetővé teszi számunkra a genomi cisz-szabályozók közötti dinamikus kölcsönhatások bioinformatikai modellezését. elemek és transz-effektorok, például transzkripciós faktorok, kromatin-remodelling komplexek és lncRNS-ek. Továbbá, mivel az újonnan felmerülő bizonyítékok az lncRNS-ek és a DNS-metiláció közötti áthallást is feltárták, a citozin DNS metilációs állapotainak genomszintű azonosítását fogjuk végrehajtani egybázisos felbontásban MethylC-seq technikával, hogy kiegészítsük és javítsuk génszabályozó hálózati modellünket. . Miután meghatároztuk a T-ALL betegek epigenetikai tájait, a T-ALL sejtvonal modellekben a kromatin és a transzkriptomikus tájat is jellemezni kívánjuk, mind kontroll körülmények között, mind a cél lncRNS-ek leütése esetén (további részletekért lásd a 3. célt). . Ez a kísérlet segítene megerősíteni és élesíteni a vizsgált lncRNS-ek működési mechanizmusának modelljét. Ez a funkcionális kísérletek és számítási modellek keresztező stratégiája biztosítja az epigenetikai és transzkriptomikus kapcsolatok mechanikus megértését a gyermekkori TALL-ban, és mindenekelőtt utat nyit a diagnosztikai és terápiás beavatkozás új stratégiáinak.

3. specifikus cél Az azonosított lncRNS-ek epigenom módosulásokon betöltött szerepének értékelése megfelelő T-ALL sejtvonal-modellrendszerekkel.

Miután megvizsgáltuk a T-ALL betegek epigenomját az egészséges alanyokkal összehasonlítva, folytatjuk az azonosított lncRNS-ek leukemogenezisben való részvételének felmérését. Az Aim3 tevékenységeit az UO3-mal együttműködve hajtják végre, amely minden eszközzel és képességgel rendelkezik e kísérleti fázis támogatásához. Folytatjuk az azonosított lncRNS-ek átmeneti elnémítását az azokat a legmagasabb szinten expresszáló T-ALL modell sejtvonalakban. A csendesítési kísérletekhez hagyományos (lipofektamin vagy lentivírus vektorok) vagy innovatív módszereket alkalmazunk. Különösen egy amerikai cég (FANA-ASO, oligonukleotid, AUMBiotech, USA) által nemrégiben kifejlesztett módszer, amely módosított oligonukleotidok felhasználásán alapul, amelyek transzfekciós szerek használata nélkül képesek bejutni a vérképző sejtekbe, és amelyekről ismert, hogy toxikusak a sejtek számára. A FANA-ASO egy olyan technológia, amelyet bőségesen alkalmaznak a klasszikus transzfekciós módszerekkel nehezen transzfektálható hematopoietikus modellekben a céltranszkriptumok elhallgattatására. Ezenkívül magas elnémítási hatékonyságot biztosítanak olyan molekulák számára, mint például az lncRNS-ek.

A kiválasztott T-ALL modellrendszerekben minden lncRNS külön-külön lesz elnémítva. A tranziens transzfekció után a csendesítés hatékonyságát q-RT-PCR-rel ellenőrizzük különböző időpontokban. Ezután azt javasoljuk, hogy elemezzük az lncRNS leütésének a tumor progressziójára gyakorolt ​​hatását a transzfektált sejtek biológiai viselkedésében bekövetkezett változások értékelésével (pl.

proliferáció, sejtciklus progresszió és motilitási képességek), a sejt fenotípusának változásai (háromdimenziós tenyésztési vizsgálat elvégzésével), epiteliális-mezenchimális átmenet (EMT), őssejtmarkerek, oxidatív stressz és gyógyszerérzékenység (életképességi vizsgálat vagy IC50 elvégzésével) számítás). A kapott eredményektől függően egyidejűleg két lncRNS-sel kapcsolt elnémítási kísérleteket is figyelembe kell venni. Azon lncRNS-ek esetében, amelyek a legnagyobb hatással voltak a kiválasztott modellekre, megvizsgáljuk, hogy az lncRNS-ek milyen hatással vannak a kromatin átszervezésére, a 2. célban leírt NGS-módszerek alkalmazásával, összehasonlítva a csendesített lncRNS-modelleket a kezeletlen kontrollhoz képest. . Ezek az adatok lehetővé teszik számunkra, hogy értékeljük az azonosított lncRNS-ek expressziós szintjei és a leukémiás T-sejtek sajátos kromatin-elváltozásai közötti összefüggéseket. Ezek a kísérletek arra késztettek bennünket, hogy azonosítsunk egy specifikus génszabályozó hálózatot, amely a kiválasztott lncRNS-ekhez kapcsolódik. A laboratóriumi padról a betegágyak felé haladva a kiválasztott lncRNS-eket közvetlenül a gyermekkori T-Blasztokban elhallgattatjuk, és értékeljük a kiválasztott lncRNS génszabályozó hálózatának részeként azonosított gén szintjének változásait.

Az azonosított elváltozásokat azután korrelálni lehet a betegség klinikai jellemzőivel, hogy értékelni lehessen a terápiás válaszra gyakorolt ​​hatásukat.