Långa icke-kodande RNA och deras roll på epigenom som diagnostiska markörer vid akut lymfoblastisk leukemi hos barn hos T-celler.

Specifikt mål 1 Utvärdering av lncRNAs i en kohort av T-ALL-patienter i jämförelse med T-naiva lymfocyter och PBMC från friska försökspersoner. Identifiering av de bäst lämpade in vitro-modellerna. För att uppnå målet med mål 1 planerade vi att registrera en kohort av pediatriska patienter som drabbats av T-ALL på sjukhuset Pausilipon, UO2, som är ett referenscenter för behandling av onkologiska sjukdomar i Kampanien. För patientrekrytering kommer specifikt och detaljerat informerat samtycke att användas enligt den nuvarande allmänna dataskyddsförordningen. De insamlade och bearbetade biologiska proverna kommer att lagras i SDN Biobank, som är den institutionella biobanken för IRCCS Synlab SDN och är medlem i BBMRI-ERIC-infrastrukturen. Med tanke på att barndomens T-ALL är sällsynt cancer, med en incidens i den pediatriska populationen av 1 fall vart 100 000 barn, planerar vi att registrera 16-20 T-ALL-patienter. Med utgångspunkt från RNA-seq-data som tidigare erhållits av vårt laboratorium, jämförde 6 pediatriska T-ALL med naiva T-celler härrörande från navelsträngsblod, identifierade vi en uppsättning differentiellt reglerade lncRNA. Från dessa valde vi 6 bland de mest uppreglerade lncRNA som aldrig har associerats med leukemi, i allmänhet, och pediatrisk akut T-cellsleukemi i synnerhet. De 6 uppreglerade utvalda lncRNA:erna är: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG000005), (ACG0041001.401010610201010101010101010101010101010100100201010020101002010020100201010100200201.301. 6), AC247036.1 (ENSG00000271201). Med hjälp av våra och andra offentliga datauppsättningar av RNA-seq-experiment kommer vi att bekräfta våra förslag i silico och sedan fortsätta till efterföljande analyser på biologiska prover. Expressionsnivåerna för dessa lncRNA kommer att analyseras ex vivo, med hjälp av RT-PCR-experiment, i den utvalda kohorten i jämförelse med PBMC härrörande från friska försökspersoner och pediatriska patienter med akut lymfoblastisk leukemi hos B-celler (B-ALL) (redan närvarande i vår Biobank) för att fastställa överuttryck i T-ALL-populationen och specificitet med avseende på en annan pediatrisk hematologisk sjukdom såsom B-ALL. Dessutom kommer transkriptnivåerna för de utvalda lncRNA:erna att analyseras i minst 5 cellinjers modellsjukdom, för både T-ALL och B-ALL. Dessa data gör det möjligt för oss att välja de bästa cellulära modellerna för efterföljande funktionsstudier. LncRNA-expressionsdata kommer att korsreferens med kliniska data från T-ALL pediatriska försökspersoner för att identifiera en korrelation mellan uttrycket av lncRNA och patientresultat och för att erhålla en molekylär signatur av lncRNA specifika för T-ALL som kommer att vara användbar för diagnos och för förbättring av pediatrisk patienthantering.

Specifikt mål 2 Identifiering av cis-regulatoriska element som är differentiellt tillgängliga mellan pediatriska T-ALL-patienter och friska försökspersoner, utvärdering av epigenetiska modifieringar av loci som identifierats ovan, och genreglerande nätverk som modellerar för att reda ut den funktionella rollen för kandidat-lncRNA i barndomens T-ALL. Aktuella framsteg inom sekvensering med hög genomströmning och bioinformatiska tillvägagångssätt framhävde att lncRNA kan reglera genuttryck på epigenetiska, transkriptionella och post-transkriptionella nivåer. När det gäller den epigenetiska sidan kan de driva betydande förändringar i kromatinarkitektur, DNA-metylering och histonmodifieringar. Till exempel kan lncRNA:er vägleda transkriptionella regulatorer till specifika genomiska loci eller underlätta kommunikationen mellan förstärkare och promotor genom att driva en direkt eller indirekt ommodellering av kromatinveckningen. Idag är det välkänt att dessa typer av epigenetiska regleringsmekanismer har en kritisk inverkan på olika steg av malignitets debut och progression, från okontrollerad spridning till apoptosresistens, förändrar kromatintillgängligheten och metyleringstillståndet för cis-regulatoriska element och leder därför till avvikande gen. uttryck i tumörer med avseende på den friska motsvarigheten. Trots det faktum att epigenetiska förändringar också är kända för att vara en nyckelfaktor vid leukemi, har knappa framsteg gjorts för att belysa den centrala rollen för lncRNA på det epigenomiska landskapet hos ALLA patienter, än mindre pediatriska. Endast ett fåtal specifika lncRNAs har identifierats och de flesta av frågorna om deras regulatoriska funktion som potentiella onkogener eller tumörsuppressorer förblir obesvarade och till och med obesvarade. För mål 2 kommer vi att avslöja den regulatoriska dynamiken som samspelar mellan lncRNA, epigenetiska faktorer och onkogenexpression. Vi planerar att koppla RNA-seq med ATAC-seq och MethylC-seq experiment i T-ALL pediatriska patientprover i jämförelse med naiva T-celler från navelsträngsblod. ATAC-seq fångar öppna kromatinregioner, vanligtvis trimetylerade vid H3K4, H3K36 och H3K79, som vanligtvis korrelerar med cis-regulatoriska element. ATACseq av T-ALL-prover kommer att tillhandahålla genomiska regioner av intresse för att förutsäga förmodade lncRNA-genom-DNA-bindningsställen via beräkningsmetoder och, i kombination med transkriptomik och funktionella analyser, kommer denna teknologi att tillåta oss att bioinformatiskt modellera de dynamiska interaktionerna mellan genomisk cis-regulatorisk element och trans-effektorer såsom transkriptionsfaktorer, kromatinremodelleringskomplex och lncRNA. Vidare, eftersom framväxande bevis har avslöjat en överhörning även mellan lncRNA och DNA-metylering, kommer vi att utföra en genomomfattande identifiering av cytosin-DNA-metyleringstillstånd vid enkelbasupplösning genom MethylC-seq-teknik för att komplettera och förbättra vår genreglerande nätverksmodell . När de epigenetiska landskapen för T-ALL-patienter väl har definierats, avser vi att även karakterisera kromatin- och transkriptomlandskapet i T-ALL-cellinjemodeller, både under kontrollförhållanden och vid nedbrytningen av mål-lncRNA (se Aim3 för ytterligare detaljer) . Detta experiment skulle hjälpa oss att bekräfta och skärpa vår modell av operativa mekanismer för lncRNA som undersöks. Denna korsskjutande strategi av funktionella experiment och beräkningsmodeller kommer att ge mekanistisk förståelse av epigenetiska och transkriptomiska relationer i pediatrisk TALL och kommer framför allt att bana väg för nya strategier för diagnostisk och terapeutisk intervention.

Specifikt mål 3 Utvärdering, med hjälp av lämpliga T-ALL-cellinjemodellsystem, av rollen av identifierade lncRNA på epigenommodifieringar.

När vi har utvärderat epigenomet för T-ALL-patienter i jämförelse med friska försökspersoner, kommer vi att fortsätta att bedöma involveringen av identifierade lncRNA i leukemogenes. Aktiviteterna i Aim3 kommer att bedrivas i samarbete med UO3, som har alla verktyg och färdigheter för att stödja denna experimentella fas. Vi kommer att gå vidare till övergående tystnad av de identifierade lncRNA:erna i T-ALL-modellcellinjerna som uttrycker dem på de högsta nivåerna. För tystnadsexperimenten kommer vi att använda traditionella (lipofektamin eller lentivirala vektorer) eller innovativa metoder. I synnerhet en metod som nyligen utvecklats av ett amerikanskt företag (FANA-ASO, oligonukleotid, AUMBiotech, USA) baserad på användningen av modifierade oligonukleotider som kan tränga in i hematopoetiska celler utan användning av transfektionsmedel, kända för att vara toxiska för celler. FANA-ASO är en teknik som används rikligt för att tysta måltranskript i hematopoetiska modeller som är svåra att transfektera med klassiska transfektionsmetoder. De ger också hög tystnadseffektivitet för molekyler som lncRNA.

I de valda T-ALL-modellsystemen kommer varje lncRNA att tystas individuellt. Efter den transienta transfektionen kommer tystnadens effektivitet att verifieras med q-RT-PCR vid olika tidpunkter. Sedan föreslår vi att analysera effekterna av lncRNA knockdown på tumörprogression genom att utvärdera förändringar i biologiska beteenden hos de transfekterade cellerna (dvs.

proliferation, cellcykelprogression och motilitetsförmåga), förändringar i cellfenotyp (genom att utföra tredimensionell odlingsanalys), epitelial-mesenkymal övergång (EMT), stamcellsmarkörer, oxidativ stress och läkemedelskänslighet (genom att utföra viabilitetsanalys eller IC50 beräkning). Beroende på de erhållna resultaten kommer även kopplade tystnadsexperiment med två lncRNAs samtidigt att övervägas. För de lncRNA som kommer att ha haft störst effekt på de utvalda modellerna kommer vi att utvärdera vilka effekter lncRNA har på kromatinomorganisation, genom tillämpning av NGS-metoderna som rapporterats i Mål 2, och jämför tystade lncRNA-modeller med avseende på den obehandlade kontrollen . Dessa data kommer att tillåta oss att utvärdera sambanden mellan uttrycksnivåerna för identifierade lncRNA och märkliga kromatinförändringar i leukemiska T-celler. Dessa experiment fick oss att identifiera ett specifikt genreglerande nätverk associerat med de utvalda lncRNA:erna. När vi passerar från laboratoriebänken till patientbäddarna kommer vi att tysta de utvalda lncRNA:erna direkt i barndomens T-blaster och vi kommer att utvärdera variationerna i nivåerna av genen som identifierats som en del av det genreglerande nätverket för det utvalda lncRNA:t.

De identifierade förändringarna kunde sedan korreleras med sjukdomens kliniska egenskaper för att utvärdera deras inverkan på terapeutiskt svar.