T 세포의 소아 급성 림프구성 백혈병의 진단 마커로서 긴 비코딩 RNA와 후성유전체에서의 역할.

특정 목표 1 건강한 대상의 T-Naive 림프구 및 PBMC와 비교하여 T-ALL 환자 집단의 lncRNA 평가. 가장 적합한 체외 모델 식별. 목표 1의 목표를 달성하기 위해 우리는 Campania의 종양학 질환 치료를 위한 참조 센터인 Pausilipon 병원인 UO2에 T-ALL의 영향을 받는 소아 환자 집단을 등록할 계획이었습니다. 환자 모집의 경우 현행 일반 데이터 보호 규정에 따라 구체적이고 상세한 사전 동의가 사용됩니다. 수집 및 처리된 생물학적 샘플은 IRCCS Synlab SDN의 기관 바이오뱅크이자 BBMRI-ERIC 인프라의 구성원인 SDN 바이오뱅크에 저장됩니다. 소아 T-ALL은 소아 인구 10만 명당 1명씩 발생하는 희귀암이라는 점을 고려하여 16~20명의 T-ALL 환자를 등록할 계획이다. 우리 연구실에서 이전에 얻은 RNA-seq 데이터에서 시작하여 6개의 소아 T-ALL을 제대혈에서 추출한 순수 T 세포와 비교하여 차별적으로 조절되는 lncRNA 세트를 식별했습니다. 이 중에서 우리는 일반적으로 백혈병, 특히 소아 급성 T세포 백혈병과 관련이 없는 가장 상향 조절된 lncRNA 중에서 6개를 선택했습니다. 6개의 상향 조절된 선택된 lncRNA는 다음과 같습니다: AC002454.1(ENSG00000237819), PCAT18(ENSG00000265369), HHIP-AS1(ENSG00000248890), LINC01222(ENSG00000233410), AC116351.1(ENSG00000215) 246), AC247036.1(ENSG00000271201). 우리의 것과 기타 RNA-seq 실험의 공개 데이터 세트를 사용하여 우리는 제안을 인실리코로 확인한 다음 생물학적 샘플에 대한 후속 분석을 진행할 것입니다. 이러한 lncRNA의 발현 수준은 선택된 코호트에서 RT-PCR 실험을 사용하여 생체 외에서 건강한 피험자 및 소아 급성 림프구성 백혈병 B 세포(B-ALL) 환자(우리 연구에 이미 존재함)에서 유래한 PBMC와 비교하여 분석됩니다. T-ALL 모집단의 과발현 및 B-ALL과 같은 다른 소아 혈액 질환에 대한 특이성을 확인하기 위해 Biobank). 또한 선택된 lncRNA의 전사 수준은 T-ALL 및 B-ALL 모두에 대해 최소 5개의 세포주 모델 질병에서 분석됩니다. 이러한 데이터를 통해 우리는 후속 기능 연구에 가장 적합한 세포 모델을 선택할 수 있습니다. lncRNA 발현 데이터는 lncRNA 발현과 환자 결과 사이의 상관관계를 확인하고 유용할 T-ALL에 특이적인 lncRNA의 분자적 특징을 얻기 위해 T-ALL 소아 피험자의 임상 데이터와 상호 참조됩니다. 소아환자의 진단과 관리 개선을 위해

구체적인 목표 2 소아 T-ALL 환자와 건강한 피험자 사이에서 차등적으로 접근할 수 있는 cis-조절 요소 식별, 위에서 식별된 유전자좌의 후생적 변형 평가, 유년기 T-ALL에서 후보 lncRNA의 기능적 역할을 밝히기 위한 유전자 조절 네트워크 모델링. 높은 처리량 시퀀싱 및 생물정보학 접근법의 현재 발전은 lncRNA가 후생적, 전사 및 전사 후 수준에서 유전자 발현을 조절할 수 있음을 강조했습니다. 후생적 측면에서는 염색질 구조, DNA 메틸화 및 히스톤 변형에 중요한 변화를 가져올 수 있습니다. 예를 들어, lncRNA는 전사 조절인자를 특정 게놈 유전자좌로 안내하거나 염색질 접힘의 직접적 또는 간접적 리모델링을 작동시켜 인핸서-프로모터 통신을 촉진할 수 있습니다. 오늘날 이러한 종류의 후성유전학적 조절 메커니즘은 통제되지 않는 증식부터 세포사멸 저항까지 악성 종양의 시작과 진행의 다양한 단계에 중요한 영향을 미치고, 염색질 접근성과 시스 조절 요소의 메틸화 상태를 변화시켜 이상 유전자를 유발한다는 것이 잘 알려져 있습니다. 건강한 상대와 관련하여 종양에서의 발현. 후생적 변화가 백혈병의 주요 요인으로 알려져 있음에도 불구하고, 소아 환자는 물론이고 모든 환자의 후생적 환경에 대한 lncRNA의 중추적인 역할을 밝히기 위한 진전은 거의 이루어지지 않았습니다. 특정 lncRNA는 거의 확인되지 않았으며 잠재적인 종양 유전자 또는 종양 억제 인자로서의 조절 기능에 대한 대부분의 질문에 대한 답이 없거나 묻지 않은 상태로 남아 있습니다. 목표 2에서는 lncRNA, 후생적 요인 및 종양 유전자 발현 사이의 상호 작용하는 규제 역학을 밝힐 것입니다. 우리는 제대혈의 순수 T 세포와 비교하여 T-ALL 소아 환자 샘플에서 RNA-seq을 ATAC-seq 및 MethylC-seq 실험과 결합할 계획입니다. ATAC-seq는 일반적으로 cis-조절 요소와 상관관계가 있는 H3K4, H3K36 및 H3K79에서 삼메틸화된 개방형 염색질 영역을 포착합니다. T-ALL 샘플의 ATACseq는 전산 방법을 통해 추정 lncRNA-게놈 DNA 결합 부위를 예측하기 위한 게놈 관심 영역을 제공할 것이며, 전사체학 및 기능 분석과 결합하여 이 기술을 통해 게놈 cis-조절 사이의 동적 상호 작용을 생물정보학적으로 모델링할 수 있습니다. 전사 인자, 염색질 리모델링 복합체 및 lncRNA와 같은 요소 및 트랜스 이펙터. 또한 새로운 증거가 lncRNA와 DNA 메틸화 사이의 누화를 밝혀냈기 때문에 우리는 유전자 조절 네트워크 모델을 보완하고 향상시키기 위해 MethylC-seq 기술을 통해 단일 염기 분해능으로 시토신 DNA 메틸화 상태의 게놈 전체 식별을 수행할 것입니다. . T-ALL 환자의 후생적 지형이 정의되면 제어 조건과 표적 lncRNA의 녹다운 시 T-ALL 세포주 모델의 염색질 및 전사체 지형도 특성화하려고 합니다(자세한 내용은 Aim3 참조). . 이 실험은 조사 중인 lncRNA의 작동 메커니즘에 대한 모델을 확증하고 개선하는 데 도움이 될 것입니다. 기능적 실험과 계산 모델의 이러한 교차 전략은 소아 TALL의 후성유전학적 및 전사체 관계에 대한 기계적인 이해를 제공하고 무엇보다도 진단 및 치료 개입을 위한 새로운 전략의 길을 열어줄 것입니다.

특정 목표 3 적절한 T-ALL 세포주 모델 시스템을 사용하여 후성유전체 변형에 대한 확인된 lncRNA의 역할을 평가합니다.

건강한 대상과 비교하여 T-ALL 환자의 후성유전체를 평가한 후 백혈병 발생에 확인된 lncRNA의 관련성을 평가할 것입니다. Aim3의 활동은 이 실험 단계를 지원하는 데 필요한 모든 도구와 기술을 갖춘 UO3와 협력하여 수행됩니다. 우리는 이를 최고 수준으로 발현하는 T-ALL 모델 세포주에서 확인된 lncRNA의 일시적인 침묵을 진행할 것입니다. 침묵 실험을 위해 우리는 전통적인 방법(리포펙타민 또는 렌티바이러스 벡터) 또는 혁신적인 방법을 사용할 것입니다. 특히 최근 미국 회사(FANA-ASO, 올리고뉴클레오티드, AUMBiotech, USA)에서 세포에 독성이 있는 것으로 알려진 형질감염제를 사용하지 않고 조혈세포 내로 진입할 수 있는 변형된 올리고뉴클레오티드를 기반으로 개발한 방법이다. FANA-ASO는 고전적인 형질감염 방법을 사용하여 형질감염하기 어려운 조혈 모델에서 표적 전사체의 침묵화에 풍부하게 사용되는 기술입니다. 또한 lncRNA와 같은 분자에 대해 높은 침묵 효율을 제공합니다.

선택된 T-ALL 모델 시스템에서 각 lncRNA는 개별적으로 침묵됩니다. 일시적인 형질감염 후, 침묵의 효율성은 다양한 시점에서 q-RT-PCR에 의해 검증됩니다. 그런 다음, 우리는 형질감염된 세포의 생물학적 행동 변화를 평가하여 lncRNA 녹다운이 종양 진행에 미치는 영향을 분석할 것을 제안합니다(즉,

증식, 세포 주기 진행 및 운동성 능력), 세포 표현형의 변화(3차원 배양 분석 수행을 통해), 상피-중간엽 전이(EMT), 줄기세포 마커, 산화 스트레스 및 약물 민감도(생존 분석 또는 IC50 수행을 통해) 계산). 얻은 결과에 따라 두 개의 lncRNA를 동시에 사용하는 결합 침묵 실험도 고려됩니다. 선택된 모델에 가장 큰 영향을 미칠 lncRNA의 경우, 목표 2에 보고된 NGS 방법을 적용하여 lncRNA가 염색질 재구성에 미치는 영향을 평가하고 침묵된 lncRNA 모델을 처리되지 않은 대조군과 비교합니다. . 이 데이터를 통해 확인된 lncRNA의 발현 수준과 백혈병 T 세포의 독특한 염색질 변경 사이의 관계를 평가할 수 있습니다. 이러한 실험을 통해 우리는 선택된 lncRNA와 관련된 특정 유전자 조절 네트워크를 식별하게 되었습니다. 실험실 벤치에서 환자 침대로 이동하면서 우리는 선택된 lncRNA를 유년기 T-Blast에서 직접 침묵시키고 선택된 lncRNA의 유전자 조절 네트워크의 일부로 확인된 유전자 수준의 변화를 평가할 것입니다.

확인된 변화는 치료 반응에 미치는 영향을 평가하기 위해 질병의 임상 특징과 상호 연관될 수 있습니다.