Lange niet-coderende RNA's en hun rol op het epigenoom als diagnostische markers bij acute lymfoblastische leukemie van T-cellen bij kinderen.

Specifiek doel 1 Evaluatie van lncRNA's in een cohort van T-ALL-patiënten in vergelijking met T-naïeve lymfocyten en PBMC van gezonde proefpersonen. Identificatie van de meest geschikte in vitro modellen. Om het doel van Doelstelling 1 te bereiken, waren we van plan een cohort pediatrische patiënten met T-ALL in te schrijven in het Pausilipon-ziekenhuis, de UO2, een referentiecentrum voor de behandeling van oncologische ziekten in Campanië. Voor de werving van patiënten zal specifieke en gedetailleerde geïnformeerde toestemming worden gebruikt in overeenstemming met de huidige Algemene Verordening Gegevensbescherming. De verzamelde en verwerkte biologische monsters zullen worden opgeslagen in de SDN Biobank, de institutionele biobank van IRCCS Synlab SDN en lid van de BBMRI-ERIC-infrastructuur. Gezien het feit dat T-ALL bij kinderen een zeldzame vorm van kanker is, met een incidentie in de pediatrische populatie van 1 geval per 100.000 kinderen, zijn we van plan om 16-20 T-ALL-patiënten in te schrijven. Uitgaande van RNA-seq-gegevens die eerder door ons laboratorium waren verkregen, waarbij 6 pediatrische T-ALL werd vergeleken met naïeve T-cellen afgeleid van navelstrengbloed, identificeerden we een reeks differentieel gereguleerde lncRNA's. Hieruit hebben we zes van de meest opwaarts gereguleerde lncRNA's geselecteerd die nooit in verband zijn gebracht met leukemie in het algemeen, en pediatrische acute T-celleukemie in het bijzonder. De 6 opwaarts gereguleerde geselecteerde lncRNA's zijn: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG00000233410), AC116351.1 (ENSG00000215246), AC247036.1 (ENSG00000271201). Met behulp van onze en andere openbare datasets van RNA-seq-experimenten zullen we onze suggesties in silico bevestigen en vervolgens doorgaan met daaropvolgende analyses van biologische monsters. De expressieniveaus van deze lncRNA’s zullen ex vivo worden geanalyseerd, met behulp van RT-PCR-experimenten, in het geselecteerde cohort in vergelijking met PBMC’s afkomstig van gezonde proefpersonen en pediatrische patiënten met acute lymfoblastische leukemie van B-cellen (B-ALL) (reeds aanwezig in onze Biobank) om overexpressie in de T-ALL-populatie en specificiteit met betrekking tot een andere pediatrische hematologische ziekte zoals B-ALL vast te stellen. Bovendien zullen de transcriptniveaus van de geselecteerde lncRNAs worden geanalyseerd in minimaal 5 ziektemodelcellijnen, voor zowel T-ALL als B-ALL. Deze gegevens zullen ons in staat stellen de beste cellulaire modellen te selecteren voor daaropvolgende functionele studies. De lncRNA-expressiegegevens zullen worden vergeleken met klinische gegevens van pediatrische T-ALL-proefpersonen om een ​​correlatie tussen de expressie van de lncRNA's en de uitkomsten van de patiënt te identificeren en om een ​​moleculaire signatuur van lncRNA's te verkrijgen die specifiek zijn voor T-ALL en die nuttig zal zijn voor de diagnose en voor de verbetering van de behandeling van pediatrische patiënten.

Specifiek doel 2 Identificatie van cis-regulerende elementen die verschillend toegankelijk zijn tussen pediatrische T-ALL-patiënten en gezonde proefpersonen, evaluatie van epigenetische modificaties van de hierboven geïdentificeerde loci, en modellering van genregulerende netwerken om de functionele rol van kandidaat-lncRNA's in T-ALL bij kinderen te ontrafelen. De huidige vooruitgang op het gebied van high-throughput sequencing en bio-informatica-benaderingen benadrukte dat lncRNA's genexpressie kunnen reguleren op epigenetische, transcriptionele en post-transcriptionele niveaus. Wat de epigenetische kant betreft, ze kunnen significante veranderingen teweegbrengen in de chromatine-architectuur, DNA-methylatie en histon-modificaties. lncRNA's kunnen bijvoorbeeld transcriptionele regulatoren naar specifieke genomische loci leiden of de versterker-promotercommunicatie vergemakkelijken door een directe of indirecte hermodellering van de chromatinevouwing uit te voeren. Tegenwoordig is het algemeen bekend dat dit soort epigenetische regulatiemechanismen een cruciale impact hebben op verschillende stappen van het ontstaan ​​en de progressie van maligniteiten, van ongecontroleerde proliferatie tot apoptoseresistentie, waardoor de toegankelijkheid van chromatine en de methyleringstoestand van cis-regulerende elementen veranderen en daarom leiden tot afwijkende genen. expressie in tumoren ten opzichte van de gezonde tegenhanger. Ondanks het feit dat bekend is dat epigenetische veranderingen ook een sleutelfactor zijn bij leukemie, is er weinig vooruitgang geboekt om de cruciale rol van lncRNA's in het epigenomische landschap van ALLE patiënten, laat staan ​​pediatrische patiënten, op te helderen. Er zijn slechts enkele specifieke lncRNA's geïdentificeerd en de meeste vragen over hun regulerende functie als potentiële oncogenen of tumoronderdrukkers blijven onbeantwoord en zelfs niet gesteld. Voor Doel 2 zullen we de regulerende dynamiek onthullen die een wisselwerking heeft tussen lncRNA's, epigenetische factoren en oncogenexpressie. We zijn van plan om RNA-seq te koppelen aan ATAC-seq- en MethylC-seq-experimenten in monsters van pediatrische T-ALL-patiënten in vergelijking met naïeve T-cellen uit navelstrengbloed. ATAC-seq vangt open chromatinegebieden op, meestal getrimethyleerd op H3K4, H3K36 en H3K79, die doorgaans correleren met cis-regulerende elementen. ATACseq van T-ALL-monsters zal genomische interessegebieden opleveren om vermeende lncRNA-genoom-DNA-bindingsplaatsen te voorspellen via computationele methoden. In combinatie met transcriptomics en functionele analyses zal deze technologie ons in staat stellen om bio-informatisch de dynamische interacties tussen genomische cis-regulerende componenten te modelleren. elementen en trans-effectoren zoals transcriptiefactoren, chromatine-remodelleringscomplexen en lncRNA's. Verder zullen we, omdat opkomend bewijsmateriaal ook een overspraak tussen lncRNA's en DNA-methylatie heeft blootgelegd, een genoombrede identificatie van cytosine-DNA-methylatietoestanden met een resolutie van één base uitvoeren via de MethylC-seq-techniek om ons genregulerende netwerkmodel aan te vullen en te verbeteren. . Zodra de epigenetische landschappen van T-ALL-patiënten zijn gedefinieerd, zijn we van plan ook het chromatine- en transcriptomische landschap in T-ALL-cellijnmodellen te karakteriseren, zowel onder controleomstandigheden als bij de knockdown van de doel-lncRNA's (zie Doel 3 voor meer details). . Dit experiment zou ons helpen ons model van het werkingsmechanisme voor de onderzochte lncRNA's te bevestigen en aan te scherpen. Deze kruisbestuivingsstrategie van functionele experimenten en computationele modellen zal mechanistisch inzicht verschaffen in epigenetische en transcriptomische relaties bij pediatrische TALL en zal bovenal de weg vrijmaken voor nieuwe strategieën voor diagnostische en therapeutische interventie.

Specifiek doel 3 Evaluatie, met behulp van geschikte T-ALL-cellijnmodelsystemen, van de rol van geïdentificeerde lncRNA's op epigenoommodificaties.

Nadat we het epigenoom van T-ALL-patiënten hebben geëvalueerd in vergelijking met gezonde proefpersonen, zullen we doorgaan met het beoordelen van de betrokkenheid van geïdentificeerde lncRNA's bij leukemogenese. De activiteiten van Aim3 zullen worden uitgevoerd in samenwerking met het UO3, dat over alle tools en vaardigheden beschikt om deze experimentele fase te ondersteunen. We zullen doorgaan met het tijdelijk uitschakelen van de geïdentificeerde lncRNA's, in de T-ALL-modelcellijnen die ze op het hoogste niveau tot expressie brengen. Voor de silencing-experimenten zullen we traditionele (lipofectamine of lentivirale vectoren) of innovatieve methoden gebruiken. In het bijzonder een methode die onlangs is ontwikkeld door een Amerikaans bedrijf (FANA-ASO, oligonucleotide, AUMBiotech, VS), gebaseerd op het gebruik van gemodificeerde oligonucleotiden die in staat zijn om hematopoëtische cellen binnen te dringen zonder het gebruik van transfectiemiddelen, waarvan bekend is dat ze giftig zijn voor cellen. De FANA-ASO is een technologie die overvloedig wordt gebruikt voor het uitschakelen van doeltranscripten in hematopoietische modellen die moeilijk te transfecteren zijn met behulp van klassieke transfectiemethoden. Ze bieden ook een hoge silencing-efficiëntie voor moleculen zoals lncRNA's.

In de geselecteerde T-ALL-modelsystemen wordt elk lncRNA afzonderlijk tot zwijgen gebracht. Na de transiënte transfectie zal de efficiëntie van de uitschakeling op verschillende tijdstippen worden geverifieerd door q-RT-PCR. Vervolgens stellen we voor om de effecten van lncRNA-knockdown op tumorprogressie te analyseren door veranderingen in biologisch gedrag van de getransfecteerde cellen (d.w.z.

proliferatie, progressie van de celcyclus en motiliteitsvermogen), veranderingen in het celfenotype (door het uitvoeren van een driedimensionale kweektest), epitheliale-mesenchymale transitie (EMT), stamcelmarkers, oxidatieve stress en medicijngevoeligheid (door het uitvoeren van een levensvatbaarheidstest of IC50 berekening). Afhankelijk van de verkregen resultaten zullen ook gekoppelde silencing-experimenten met twee lncRNA's gelijktijdig worden overwogen. Voor de lncRNA's die het grootste effect op de geselecteerde modellen zullen hebben gehad, zullen we evalueren wat de effecten zijn die lncRNA's hebben op de reorganisatie van chromatine, door de toepassing van de NGS-methoden gerapporteerd in Doel 2, waarbij stille lncRNA-modellen worden vergeleken met de onbehandelde controle. . Deze gegevens zullen ons in staat stellen de relaties tussen de expressieniveaus van geïdentificeerde lncRNA's en bijzondere chromatineveranderingen in leukemische T-cellen te evalueren. Deze experimenten hebben ons ertoe aangezet een specifiek genregulerend netwerk te identificeren dat geassocieerd is met de geselecteerde lncRNA's. Als we van de laboratoriumbank naar de patiëntenbedden gaan, zullen we de geselecteerde lncRNA's direct in de T-Blasts voor kinderen tot zwijgen brengen en zullen we de variaties evalueren in de niveaus van het gen dat is geïdentificeerd als onderdeel van het genregulerende netwerk van het geselecteerde lncRNA.

De geïdentificeerde veranderingen zouden vervolgens kunnen worden gecorreleerd met de klinische kenmerken van de ziekte om hun impact op de therapeutische respons te evalueren.