RNA lunghi non codificanti e il loro ruolo sull'epigenoma come marcatori diagnostici nella leucemia linfoblastica acuta infantile delle cellule T.

Obiettivo specifico 1 Valutazione degli lncRNA in una coorte di pazienti con LLA T rispetto ai linfociti T-Naive e ai PBMC di soggetti sani. Individuazione dei modelli in vitro più idonei. Per raggiungere l'obiettivo dell'Obiettivo 1 abbiamo previsto di arruolare una coorte di pazienti pediatrici affetti da LLA T presso l'ospedale Pausilipon, l'UO2, che è un centro di riferimento per il trattamento delle malattie oncologiche in Campania. Per il reclutamento dei pazienti verrà utilizzato il consenso informato specifico e dettagliato secondo l'attuale Regolamento generale sulla protezione dei dati. I campioni biologici raccolti e processati saranno conservati nella Biobanca SDN, che è la biobanca istituzionale dell'IRCCS Synlab SDN e fa parte dell'infrastruttura BBMRI-ERIC. Considerando che la LLA T infantile è un tumore raro, con un'incidenza nella popolazione pediatrica di 1 caso ogni 100.000 bambini, prevediamo di arruolare 16-20 pazienti con LLA T. Partendo dai dati RNA-seq precedentemente ottenuti dal nostro laboratorio, confrontando 6 LAL T pediatriche con cellule T naïve derivate dal sangue cordonale, abbiamo identificato una serie di lncRNA regolati in modo differenziale. Da questi, ne abbiamo selezionati 6 tra gli lncRNA più sovraregolati che non sono mai stati associati alla leucemia, in generale, e alla leucemia acuta pediatrica a cellule T in particolare. I 6 lncRNA selezionati up-regolati sono: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG00000233410), AC116351.1 (ENSG00000215246 ), AC247036.1 (ENSG00000271201). Utilizzando i nostri e altri set di dati pubblici di esperimenti RNA-seq, confermeremo i nostri suggerimenti in silico e quindi procederemo alle successive analisi su campioni biologici. I livelli di espressione di questi lncRNA saranno analizzati ex vivo, utilizzando esperimenti di RT-PCR, nella coorte selezionata in confronto con PBMC derivati ​​da soggetti sani e pazienti pediatrici con leucemia linfoblastica acuta a cellule B (LLA B) (già presenti nel nostro studio). Biobank) per accertare la sovraespressione nella popolazione della LLA-T e la specificità rispetto ad un'altra malattia ematologica pediatrica come la LLA-B. Inoltre, i livelli di trascrizione degli lncRNA selezionati saranno analizzati in un minimo di 5 linee cellulari modello di malattia, sia per la LLA T che per la LLA B. Questi dati ci permetteranno di selezionare i migliori modelli cellulari per successivi studi funzionali. I dati di espressione degli lncRNA verranno incrociati con i dati clinici di soggetti pediatrici con LLA T al fine di identificare una correlazione tra l'espressione degli lncRNA e gli esiti dei pazienti e di ottenere una firma molecolare degli lncRNA specifica per la LLA T che sarà utile per la diagnosi e per il miglioramento della gestione del paziente pediatrico.

Obiettivo specifico 2 Identificazione di elementi cis-regolatori differenzialmente accessibili tra pazienti pediatrici con LLA T e soggetti sani, valutazione delle modificazioni epigenetiche dei loci sopra identificati e modellazione delle reti di regolazione genetica per svelare il ruolo funzionale dei candidati lncRNA nella T-ALL infantile. Gli attuali progressi nel sequenziamento ad alto rendimento e negli approcci bioinformatici hanno evidenziato che gli lncRNA possono regolare l'espressione genica a livello epigenetico, trascrizionale e post-trascrizionale. Per quanto riguarda l’aspetto epigenetico, possono determinare cambiamenti significativi nell’architettura della cromatina, nella metilazione del DNA e nelle modifiche degli istoni. Ad esempio, gli lncRNA possono guidare i regolatori trascrizionali verso specifici loci genomici o facilitare la comunicazione potenziatore-promotore operando un rimodellamento diretto o indiretto del ripiegamento della cromatina. Oggi è ben noto che questi tipi di meccanismi di regolazione epigenetica hanno un impatto critico sulle diverse fasi di insorgenza e progressione della malignità, dalla proliferazione incontrollata alla resistenza all'apoptosi, alterando l'accessibilità della cromatina e lo stato di metilazione degli elementi cis-regolatori e quindi portando a geni aberranti espressione nei tumori rispetto alla controparte sana. Nonostante sia noto che le alterazioni epigenetiche sono un fattore chiave anche nella leucemia, sono stati fatti scarsi progressi per chiarire il ruolo chiave degli lncRNA nel panorama epigenomico di TUTTI i pazienti, per non parlare di quelli pediatrici. Sono stati identificati solo pochi lncRNA specifici e la maggior parte delle domande sulla loro funzione regolatoria come potenziali oncogeni o soppressori tumorali rimangono senza risposta e persino non poste. Per l'Obiettivo 2, sveleremo le dinamiche regolatorie che interagiscono tra lncRNA, fattori epigenetici ed espressione di oncogeni. Progettiamo di accoppiare esperimenti di RNA-seq con ATAC-seq e MethylC-seq in campioni di pazienti pediatrici con T-ALL in confronto con cellule T naïve provenienti da sangue cordonale. ATAC-seq cattura regioni di cromatina aperte, solitamente trimetilate in H3K4, H3K36 e H3K79, che tipicamente sono correlate con elementi regolatori cis. ATACseq di campioni di T-ALL fornirà regioni genomiche di interesse per prevedere i presunti siti di legame del DNA del genoma lncRNA tramite metodi computazionali e, in combinazione con la trascrittomica e le analisi funzionali, questa tecnologia ci consentirà di modellare bioinformaticamente le interazioni dinamiche tra genomica cis-regolatoria elementi e trans-effettori come fattori di trascrizione, complessi di rimodellamento della cromatina e lncRNA. Inoltre, poiché le evidenze emergenti hanno scoperto una diafonia anche tra lncRNA e metilazione del DNA, eseguiremo un'identificazione a livello dell'intero genoma degli stati di metilazione del DNA della citosina con risoluzione a base singola attraverso la tecnica MethylC-seq al fine di integrare e migliorare il nostro modello di rete di regolamentazione genetica . Una volta definiti i paesaggi epigenetici dei pazienti affetti da LLA T, intendiamo caratterizzare anche il panorama cromatinico e trascrittomico nei modelli di linee cellulari di LLA T, sia in condizioni di controllo che dopo l'abbattimento degli lncRNA target (vedere Obiettivo 3 per ulteriori dettagli) . Questo esperimento ci aiuterebbe a corroborare e affinare il nostro modello del meccanismo operativo per gli lncRNA in esame. Questa strategia incrociata di esperimenti funzionali e modelli computazionali fornirà una comprensione meccanicistica delle relazioni epigenetiche e trascrittomiche nella TALL pediatrica e, soprattutto, aprirà la strada a nuove strategie di intervento diagnostico e terapeutico.

Obiettivo specifico 3 Valutazione, utilizzando appropriati sistemi modello di linee cellulari T-ALL, del ruolo degli lncRNA identificati sulle modificazioni dell'epigenoma.

Una volta valutato l'epigenoma dei pazienti con LLA T rispetto ai soggetti sani, procederemo a valutare il coinvolgimento degli lncRNA identificati nella leucemogenesi. Le attività di Aim3 saranno condotte in collaborazione con l'UO3, che dispone di tutti gli strumenti e le competenze per supportare questa fase sperimentale. Si procederà al silenziamento transitorio degli lncRNA identificati, nelle linee cellulari modello T-ALL che li esprimono ai massimi livelli. Per gli esperimenti di silenziamento utilizzeremo metodi tradizionali (lipofectamina o vettori lentivirali) o innovativi. In particolare, un metodo recentemente sviluppato da un'azienda americana (FANA-ASO, oligonucleotide, AUMBiotech, USA) basato sull'utilizzo di oligonucleotidi modificati in grado di entrare nelle cellule ematopoietiche senza l'utilizzo di agenti di trasfezione, noti per essere tossici per le cellule. La FANA-ASO è una tecnologia ampiamente utilizzata per il silenziamento delle trascrizioni target in modelli ematopoietici difficili da trasfettare utilizzando i metodi di trasfezione classici. Forniscono inoltre un'elevata efficienza di silenziamento per molecole come gli lncRNA.

Nei sistemi modello T-ALL selezionati, ciascun lncRNA verrà silenziato individualmente. Dopo la trasfezione transitoria, l'efficienza del silenziamento sarà verificata mediante q-RT-PCR a diversi tempi. Quindi, proponiamo di analizzare gli effetti del knockdown dell'lncRNA sulla progressione del tumore valutando i cambiamenti nei comportamenti biologici delle cellule trasfettate (es.

proliferazione, progressione del ciclo cellulare e capacità di motilità), cambiamenti nel fenotipo cellulare (eseguendo un test di coltura tridimensionale), transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), marcatori di cellule staminali, stress ossidativo e sensibilità ai farmaci (eseguendo test di vitalità o IC50 calcolo). A seconda dei risultati ottenuti, verranno presi in considerazione anche esperimenti di silenziamento accoppiato con due lncRNA simultaneamente. Per gli lncRNA che avranno avuto il maggiore effetto sui modelli selezionati, valuteremo quali sono gli effetti che gli lncRNA hanno sulla riorganizzazione della cromatina, attraverso l'applicazione dei metodi NGS riportati nell'Obiettivo 2, confrontando i modelli di lncRNA silenziati rispetto al controllo non trattato . Questi dati ci permetteranno di valutare la relazione tra i livelli di espressione degli lncRNA identificati e le peculiari alterazioni della cromatina nelle cellule T leucemiche. Questi esperimenti ci hanno spinto a identificare una specifica rete di regolazione genetica associata agli lncRNA selezionati. Passando dal banco di laboratorio ai letti dei pazienti, silenzieremo gli lncRNA selezionati direttamente nei T-Blast infantili e valuteremo le variazioni nei livelli del gene identificato come parte della rete di regolazione genetica degli lncRNA selezionati.

Le alterazioni identificate potrebbero poi essere correlate con le caratteristiche cliniche della malattia al fine di valutarne l'impatto sulla risposta terapeutica.