Les ARN longs non codants et leur rôle sur l'épigénome en tant que marqueurs diagnostiques dans la leucémie lymphoblastique aiguë des cellules T chez l'enfant.

Objectif spécifique 1 Évaluation des ARNnc dans une cohorte de patients T-ALL par rapport aux lymphocytes T-Naive et aux PBMC de sujets sains. Identification des modèles in vitro les mieux adaptés. Pour atteindre l'objectif de l'objectif 1, nous avons prévu de recruter une cohorte de patients pédiatriques atteints de T-ALL à l'hôpital de Pausilipon, l'UO2, qui est un centre de référence pour le traitement des maladies oncologiques en Campanie. Pour le recrutement des patients, un consentement éclairé spécifique et détaillé sera utilisé conformément au règlement général sur la protection des données en vigueur. Les échantillons biologiques collectés et traités seront stockés dans la biobanque SDN, qui est la biobanque institutionnelle de l'IRCCS Synlab SDN et est membre de l'infrastructure BBMRI-ERIC. Considérant que la T-ALL infantile est un cancer rare, avec une incidence dans la population pédiatrique de 1 cas pour 100 000 enfants, nous prévoyons d'inscrire 16 à 20 patients T-ALL. À partir de données de séquençage d'ARN précédemment obtenues par notre laboratoire, comparant 6 LAL-T pédiatriques avec des lymphocytes T naïfs dérivés du sang de cordon, nous avons identifié un ensemble d'ARNnc régulés différentiellement. Parmi ceux-ci, nous avons sélectionné 6 ARNnc parmi les plus régulés positivement qui n’ont jamais été associés à la leucémie, en général, et à la leucémie aiguë à cellules T pédiatriques en particulier. Les 6 ARNnc sélectionnés régulés positivement sont : AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG00000233410), AC116351.1 (ENSG00000215246), AC247036.1 (ENSG00000271201). En utilisant les nôtres et d’autres ensembles de données publics d’expériences de séquençage d’ARN, nous confirmerons nos suggestions in silico, puis procéderons à des analyses ultérieures sur des échantillons biologiques. Les niveaux d'expression de ces lncRNA seront analysés ex vivo, à l'aide d'expériences RT-PCR, dans la cohorte sélectionnée en comparaison avec les PBMC dérivées de sujets sains et de patients pédiatriques atteints de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules B (LAL-B) (déjà présentes dans notre Biobanque) pour vérifier la surexpression dans la population T-ALL et la spécificité par rapport à une autre maladie hématologique pédiatrique telle que B-ALL. De plus, les niveaux de transcription des lncARN sélectionnés seront analysés dans un minimum de 5 lignées cellulaires modèles de maladie, à la fois pour T-ALL et B-ALL. Ces données nous permettront de sélectionner les meilleurs modèles cellulaires pour des études fonctionnelles ultérieures. Les données d'expression des lncARN seront croisées avec les données cliniques de sujets pédiatriques T-ALL afin d'identifier une corrélation entre l'expression des lncARN et les résultats pour les patients et d'obtenir une signature moléculaire des lncARN spécifiques de T-ALL qui sera utile pour le diagnostic et pour l’amélioration de la prise en charge des patients pédiatriques.

Objectif spécifique 2 Identification des éléments cis-régulateurs différentiellement accessibles entre les patients pédiatriques T-ALL et les sujets sains, évaluation des modifications épigénétiques des loci identifiés ci-dessus et modélisation des réseaux de régulation génique pour découvrir le rôle fonctionnel des ARNnc candidats dans la T-ALL infantile. Les progrès actuels dans le séquençage à haut débit et les approches bioinformatiques ont mis en évidence que les ARNnc peuvent réguler l’expression des gènes aux niveaux épigénétique, transcriptionnel et post-transcriptionnel. Quant au côté épigénétique, ils peuvent entraîner des changements significatifs dans l’architecture de la chromatine, la méthylation de l’ADN et les modifications des histones. Par exemple, les lncARN peuvent guider les régulateurs transcriptionnels vers des locus génomiques spécifiques ou faciliter la communication amplificateur-promoteur en opérant un remodelage direct ou indirect du repliement de la chromatine. Il est aujourd’hui bien connu que ces types de mécanismes de régulation épigénétique ont un impact critique sur les différentes étapes de l’apparition et de la progression d’une tumeur maligne, depuis la prolifération incontrôlée jusqu’à la résistance à l’apoptose, altérant l’accessibilité de la chromatine et l’état de méthylation des éléments cis-régulateurs et conduisant ainsi à des gènes aberrants. expression dans les tumeurs par rapport à son homologue sain. Malgré le fait que les altérations épigénétiques soient également connues pour être un facteur clé de la leucémie, peu de progrès ont été réalisés pour élucider le rôle central des ARNnc dans le paysage épigénomique de TOUS les patients, sans parler des patients pédiatriques. Seuls quelques ARNnc spécifiques ont été identifiés et la plupart des questions sur leur fonction régulatrice en tant qu'oncogènes potentiels ou suppresseurs de tumeurs restent sans réponse, voire non posées. Pour l'objectif 2, nous dévoilerons la dynamique de régulation interagissant entre les lncARN, les facteurs épigénétiques et l'expression des oncogènes. Nous prévoyons de coupler des expériences RNA-seq avec ATAC-seq et MéthylC-seq dans des échantillons de patients pédiatriques T-ALL en comparaison avec des lymphocytes T naïfs provenant du sang de cordon. ATAC-seq capture les régions ouvertes de la chromatine, généralement triméthylées en H3K4, H3K36 et H3K79, qui sont généralement en corrélation avec les éléments cis-régulateurs. ATACseq des échantillons T-ALL fournira des régions génomiques d'intérêt pour prédire les sites putatifs de liaison à l'ADN lncRNA-génome via des méthodes informatiques et, en combinaison avec la transcriptomique et les analyses fonctionnelles, cette technologie nous permettra de modéliser bioinformatiquement les interactions dynamiques entre les cis-régulateurs génomiques. éléments et trans-effecteurs tels que les facteurs de transcription, les complexes de remodelage de la chromatine et les ARNnc. De plus, alors que de nouvelles preuves ont également révélé une diaphonie entre les ARNnc et la méthylation de l'ADN, nous effectuerons une identification à l'échelle du génome des états de méthylation de l'ADN de la cytosine à une résolution de base unique grâce à la technique MéthylC-seq afin de compléter et d'améliorer notre modèle de réseau de régulation génique. . Une fois que les paysages épigénétiques des patients T-ALL auront été définis, nous avons l'intention de caractériser également le paysage chromatinien et transcriptomique dans les modèles de lignées cellulaires T-ALL, à la fois dans des conditions de contrôle et lors de l'inactivation des lncARN cibles (voir Aim3 pour plus de détails). . Cette expérience nous aiderait à corroborer et à affiner notre modèle du mécanisme de fonctionnement des lncRNA étudiés. Cette stratégie croisée d'expériences fonctionnelles et de modèles informatiques fournira une compréhension mécaniste des relations épigénétiques et transcriptomiques dans le TALL pédiatrique et, surtout, ouvrira la voie à de nouvelles stratégies d'intervention diagnostique et thérapeutique.

Objectif spécifique 3 Évaluation, à l'aide de systèmes modèles de lignées cellulaires T-ALL appropriés, du rôle des ARNnc identifiés sur les modifications de l'épigénome.

Une fois évalué l'épigénome des patients T-ALL par rapport à des sujets sains, nous procéderons à l'évaluation de l'implication des ARNnc identifiés dans la leucémogenèse. Les activités d'Aim3 seront menées en collaboration avec l'UO3, qui dispose de tous les outils et compétences pour accompagner cette phase expérimentale. Nous procéderons au silençage transitoire des lncRNA identifiés, dans les lignées cellulaires modèles T-ALL qui les expriment aux niveaux les plus élevés. Pour les expériences de silencing, nous utiliserons des méthodes traditionnelles (lipofectamine ou vecteurs lentiviraux) ou innovantes. Notamment une méthode récemment développée par une société américaine (FANA-ASO, oligonucléotide, AUMBiotech, USA) basée sur l'utilisation d'oligonucléotides modifiés capables de pénétrer dans les cellules hématopoïétiques sans recours à des agents de transfection, connus pour être toxiques pour les cellules. Le FANA-ASO est une technologie abondamment utilisée pour faire taire les transcrits cibles dans des modèles hématopoïétiques difficiles à transfecter à l’aide des méthodes de transfection classiques. Ils offrent également une efficacité de silençage élevée pour des molécules telles que les ARNnc.

Dans les systèmes modèles T-ALL sélectionnés, chaque lncRNA sera réduit au silence individuellement. Après la transfection transitoire, l'efficacité du silençage sera vérifiée par q-RT-PCR à différents moments. Ensuite, nous proposons d'analyser les effets du knockdown des lncRNA sur la progression tumorale en évaluant les changements dans les comportements biologiques des cellules transfectées (c.-à-d.

prolifération, progression du cycle cellulaire et capacités de motilité), modifications du phénotype cellulaire (en effectuant un test de culture tridimensionnel), transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT), marqueurs de cellules souches, stress oxydatif et sensibilité aux médicaments (en effectuant un test de viabilité ou IC50 calcul). En fonction des résultats obtenus, des expériences de silencing couplées avec deux lncARN simultanément seront également envisagées. Pour les lncARN qui auront eu le plus grand effet sur les modèles sélectionnés, nous évaluerons quels sont les effets des lncARN sur la réorganisation de la chromatine, grâce à l'application des méthodes NGS rapportées dans l'objectif 2, en comparant les modèles lncARN silencieux par rapport au contrôle non traité. . Ces données nous permettront d'évaluer les relations entre les niveaux d'expression des ARNnc identifiés et les altérations particulières de la chromatine dans les cellules T leucémiques. Ces expériences nous ont incité à identifier un réseau de régulation génique spécifique associé aux ARNnc sélectionnés. En passant de la paillasse du laboratoire aux lits des patients, nous ferons taire les lncRNA sélectionnés directement dans les T-Blasts de l'enfance et nous évaluerons les variations des niveaux du gène identifié comme faisant partie du réseau de régulation génique de l'ARNlnc sélectionné.

Les altérations identifiées pourraient ensuite être corrélées aux caractéristiques cliniques de la maladie afin d'évaluer leur impact sur la réponse thérapeutique.