ARN largos no codificantes y su papel en el epigenoma como marcadores de diagnóstico en la leucemia linfoblástica aguda de células T infantiles.

Objetivo específico 1 Evaluación de lncRNA en una cohorte de pacientes con LLA-T en comparación con linfocitos T-naive y PBMC de sujetos sanos. Identificación de los modelos in vitro más adecuados. Para lograr el objetivo del objetivo 1, planeamos inscribir una cohorte de pacientes pediátricos afectados por T-ALL en el hospital Pausilipon, la UO2, que es un centro de referencia para el tratamiento de enfermedades oncológicas en Campania. Para el reclutamiento de pacientes se utilizará el consentimiento informado específico y detallado según el Reglamento General de Protección de Datos vigente. Las muestras biológicas recolectadas y procesadas se almacenarán en el SDN Biobank, que es el biobanco institucional de IRCCS Synlab SDN y es miembro de la infraestructura BBMRI-ERIC. Teniendo en cuenta que la LLA-T infantil es un cáncer poco común, con una incidencia en la población pediátrica de 1 caso cada 100.000 niños, planeamos inscribir entre 16 y 20 pacientes con LLA-T. A partir de datos de RNA-seq obtenidos previamente por nuestro laboratorio, comparando 6 LLA-T pediátrica con células T vírgenes derivadas de la sangre del cordón umbilical, identificamos un conjunto de lncRNA regulados diferencialmente. De estos, seleccionamos 6 entre los lncRNA más regulados que nunca se han asociado con la leucemia, en general, y con la leucemia aguda pediátrica de células T en particular. Los 6 lncRNA seleccionados regulados positivamente son: AC002454.1 (ENSG00000237819), PCAT18 (ENSG00000265369), HHIP-AS1 (ENSG00000248890), LINC01222 (ENSG00000233410), AC116351.1 (ENSG00000215246), AC247036.1 (ENSG00000271201). Utilizando el nuestro y otros conjuntos de datos públicos de experimentos de RNA-seq, confirmaremos nuestras sugerencias in silico y luego procederemos a análisis posteriores en muestras biológicas. Los niveles de expresión de estos lncRNA se analizarán ex vivo, mediante experimentos de RT-PCR, en la cohorte seleccionada en comparación con PBMC derivadas de sujetos sanos y pacientes pediátricos con leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) (ya presentes en nuestro estudio). Biobank) para conocer la sobreexpresión en la población T-ALL y la especificidad respecto a otra enfermedad hematológica pediátrica como la B-ALL. Además, los niveles de transcripción de los lncRNA seleccionados se analizarán en un mínimo de 5 líneas celulares modelo de enfermedad, tanto para T-ALL como para B-ALL. Estos datos nos permitirán seleccionar los mejores modelos celulares para posteriores estudios funcionales. Los datos de expresión de lncRNA se cruzarán con datos clínicos de sujetos pediátricos con T-ALL para identificar una correlación entre la expresión de los lncRNA y los resultados de los pacientes y para obtener una firma molecular de lncRNA específica para T-ALL que será útil. para el diagnóstico y para la mejora del manejo del paciente pediátrico.

Objetivo específico 2 Identificación de elementos reguladores cis accesibles diferencialmente entre pacientes pediátricos con LLA-T y sujetos sanos, evaluación de modificaciones epigenéticas de los loci identificados anteriormente y modelado de redes reguladoras de genes para desentrañar el papel funcional de los lncRNA candidatos en la LLA-T infantil. Los avances actuales en secuenciación de alto rendimiento y enfoques bioinformáticos destacaron que los lncRNA pueden regular la expresión génica a nivel epigenético, transcripcional y postranscripcional. En cuanto al lado epigenético, pueden impulsar cambios significativos en la arquitectura de la cromatina, la metilación del ADN y las modificaciones de las histonas. Por ejemplo, los lncRNA pueden guiar a los reguladores transcripcionales a loci genómicos específicos o facilitar la comunicación potenciador-promotor operando una remodelación directa o indirecta del plegamiento de la cromatina. Hoy en día es bien sabido que este tipo de mecanismos de regulación epigenética tienen un impacto crítico en diferentes etapas de la aparición y progresión de la malignidad, desde la proliferación descontrolada hasta la resistencia a la apoptosis, alterando la accesibilidad a la cromatina y el estado de metilación de los elementos reguladores en cis y, por lo tanto, dando lugar a genes aberrantes. expresión en tumores con respecto a la contraparte sana. A pesar de que se sabe que las alteraciones epigenéticas también son un factor clave en la leucemia, se han logrado pocos avances para dilucidar el papel fundamental de los lncRNA en el panorama epigenómico de los pacientes con LLA, y mucho menos en los pediátricos. Solo se han identificado unos pocos lncRNA específicos y la mayoría de las preguntas sobre su función reguladora como posibles oncogenes o supresores de tumores siguen sin respuesta e incluso sin respuesta. Para el objetivo 2, revelaremos la dinámica regulatoria que interactúa entre los lncRNA, los factores epigenéticos y la expresión de oncogenes. Planeamos acoplar experimentos de RNA-seq con ATAC-seq y MmethylC-seq en muestras de pacientes pediátricos con LLA-T en comparación con células T vírgenes de sangre del cordón umbilical. ATAC-seq captura regiones de cromatina abiertas, generalmente trimetiladas en H3K4, H3K36 y H3K79, que normalmente se correlacionan con elementos reguladores cis. ATACseq de muestras de T-ALL proporcionará regiones genómicas de interés para predecir supuestos sitios de unión de ADN del genoma de lncRNA a través de métodos computacionales y, en combinación con transcriptómica y análisis funcionales, esta tecnología nos permitirá modelar bioinformáticamente las interacciones dinámicas entre reguladores cis genómicos. elementos y transefectores como factores de transcripción, complejos de remodelación de cromatina y lncRNA. Además, a medida que las evidencias emergentes han descubierto una interferencia también entre los lncRNA y la metilación del ADN, realizaremos una identificación de todo el genoma de los estados de metilación del ADN de citosina con resolución de base única a través de la técnica MmethylC-seq para complementar y mejorar nuestro modelo de red reguladora de genes. . Una vez que se hayan definido los paisajes epigenéticos de los pacientes con LLA-T, pretendemos caracterizar también la cromatina y el paisaje transcriptómico en modelos de líneas celulares de LLA-T, tanto en condiciones de control como tras la eliminación de los lncRNA objetivo (consulte Objetivo 3 para obtener más detalles). . Este experimento nos ayudaría a corroborar y perfeccionar nuestro modelo del mecanismo operativo de los lncRNA que estamos investigando. Esta estrategia cruzada de experimentos funcionales y modelos computacionales proporcionará una comprensión mecanicista de las relaciones epigenéticas y transcriptómicas en pacientes TALL pediátricos y, sobre todo, allanará el camino hacia estrategias novedosas para la intervención diagnóstica y terapéutica.

Objetivo específico 3 Evaluación, utilizando sistemas modelo de líneas celulares T-ALL apropiados, del papel de los lncRNA identificados en las modificaciones del epigenoma.

Una vez evaluado el epigenoma de pacientes con LLA-T en comparación con sujetos sanos, procederemos a evaluar la participación de los lncRNA identificados en la leucemogénesis. Las actividades de Aim3 se llevarán a cabo en colaboración con la UO3, que cuenta con todas las herramientas y capacidades para apoyar esta fase experimental. Procederemos al silenciamiento transitorio de los lncRNA identificados, en las líneas celulares modelo T-ALL que los expresan en los niveles más altos. Para los experimentos de silenciamiento utilizaremos métodos tradicionales (lipofectamina o vectores lentivirales) o innovadores. En particular, un método desarrollado recientemente por una empresa estadounidense (FANA-ASO, oligonucleótido, AUMBiotech, EE. UU.) basado en el uso de oligonucleótidos modificados capaces de penetrar en las células hematopoyéticas sin el uso de agentes de transfección, conocidos por ser tóxicos para las células. FANA-ASO es una tecnología ampliamente utilizada para el silenciamiento de transcripciones objetivo en modelos hematopoyéticos que son difíciles de transfectar utilizando métodos de transfección clásicos. También proporcionan una alta eficiencia de silenciamiento para moléculas como los lncRNA.

En los sistemas modelo T-ALL seleccionados, cada lncRNA se silenciará individualmente. Después de la transfección transitoria, la eficacia del silenciamiento se verificará mediante q-RT-PCR en diferentes momentos. Luego, proponemos analizar los efectos de la eliminación del lncRNA en la progresión del tumor mediante la evaluación de cambios en los comportamientos biológicos de las células transfectadas (es decir,

proliferación, progresión del ciclo celular y capacidades de motilidad), cambios en el fenotipo celular (mediante un ensayo de cultivo tridimensional), transición epitelial-mesenquimatosa (EMT), marcadores de células madre, estrés oxidativo y sensibilidad a fármacos (mediante un ensayo de viabilidad o IC50 cálculo). Dependiendo de los resultados obtenidos, también se considerarán experimentos de silenciamiento acoplado con dos lncRNA simultáneamente. Para los lncRNA que habrán tenido mayor efecto en los modelos seleccionados, evaluaremos cuáles son los efectos que los lncRNA tienen en la reorganización de la cromatina, mediante la aplicación de los métodos NGS informados en el objetivo 2, comparando los modelos de lncRNA silenciados con respecto al control no tratado. . Estos datos nos permitirán evaluar las relaciones entre los niveles de expresión de los lncRNA identificados y las alteraciones peculiares de la cromatina en las células T leucémicas. Estos experimentos nos llevaron a identificar una red reguladora de genes específica asociada con los lncRNA seleccionados. Pasando de la mesa del laboratorio a las camas de los pacientes, silenciaremos los lncRNA seleccionados directamente en los T-Blasts infantiles y evaluaremos las variaciones en los niveles del gen identificado como parte de la red reguladora genética del lncRNA seleccionado.

Las alteraciones identificadas podrían luego correlacionarse con las características clínicas de la enfermedad para evaluar su impacto en la respuesta terapéutica.