カメルーンでARTを受けているHIV-1非B感染青年におけるHIV-1保有者の特性評価 (AVIR)

タイトル: カメルーンで抗レトロウイルス療法を受けている HIV-1 非 B 垂直感染青年におけるウイルス保有者の特徴付け。

頭字語: AVIR 研究、思春期ウイルス貯蔵庫

重要性と関連性 サハラ以南アフリカ (SSA) は HIV/AIDS の影響を著しく受けており、世界の流行の 70% 近くが発生しています。 小児 HIV 感染症の負担が最も高く、SSA 地域では HIV とともに生きる子どもの 10 人中約 9 人が感染しています(1、2)。 世界中で HIV とともに生きる人々の割合が増加している青少年と若者。 2019年には約170万人[110万人-240万人] 世界中で 10 歳から 19 歳までの青少年 100 万人が HIV に感染しており、これは HIV とともに生きる全人口の約 5% に相当し、約 150 万人 [100 万から 210 万人]、つまり HIV に感染した青少年の 88% が SSA に住んでいます。 2019年だけでも、10歳から24歳までの46万人[26万人から68万人]の若者が新たにHIVに感染し、そのうち17万人[5万3千人から34万人]が10歳から19歳の青少年でした。 これをさらに悪化させるのが、最新のデータによると、HIV感染が最も深刻な地域であるアフリカ東部および南部では、15～19歳の思春期の少女のわずか27％と青年期の少年の16％だけが、過去12カ月以内にHIV検査を受け、検査を受け、検査を受けていることが示されている。前回のテストの結果。 西アフリカ、中央アフリカ、南アジアの検査率はさらに低い。 現在の傾向が続けば、今後数年間でさらに数十万人がHIV陽性者となり、青少年は自分の状況が分からないまま、命を救う治療を受けられなくなるだろう。 さらに、過去 10 年間で周産期に HIV に感染した子供たちの大部分が思春期に成長しています (3)。 2019年にエイズ関連疾患で死亡した推定69万人のうち、11万人（約16％）が20歳未満の子どもだった。 (ユニセフの世界的および地域的傾向、2020 年 7 月)。

抗レトロウイルス療法 (ART) の出現と拡張性により、エイズ関連の死亡は世界的に減少しています。 2019年末の時点で、2,540万人が抗レトロウイルス療法を受けており、これはHIV感染者全体の67%に相当します。 しかし、HIV とともに生きる子どものうち ART を受けていたのは 53% のみでした。 興味深いことに、ART を受けているすべての子供たちの約 94% が SSA の子供たちです (4)。 継続的な新たな HIV 小児感染症と小児 ART の普及拡大という状況の中で、HIV とともに生きる子どもの数は増加するでしょう。これは、治療計画が HIV 感染制御に十分な効果を維持していれば、思春期に到達する可能性が高く、さらには成人に達する可能性が高いことを示唆しています (3、 4)。 したがって、ADLHIV は、健康上の懸念が増大している HIV 集団を構成しており、特に SSA において、この対象集団に特有の一般化可能なベストプラクティスに関する知見は非常に限られています。

西および中央アフリカのいくつかの国と同様に、カメルーンは依然として一般的な HIV 疫学 (有病率 2.7%) (5) に直面しており、その有病率は妊婦 (5.7%) および HIV に曝露された乳児/小児 (5.8% [958/16,638]) で高くなっています。 ] 最初の PCR で陽性率、PMTCT カスケードの終了時に 15% が陽性) (6)。 2018年6月の時点で、全国のART普及率は51.5%（281,083人）で、これには15歳未満の子供12,362人が含まれています（6人）。 カメルーンにおけるARTに対する反応に関して、我々は全体的なウイルス抑制率が79.4%であることを報告したが、年齢層によって大きな差があり、成人では81.1%、小児では75.6%、10～19歳の青年ではわずか53.3%であった(7)。 UNAIDS の報告と同様に、HIV とともに生きる青少年 (ADLHIV) は、流行に対して最も脆弱で十分なサービスを受けていない人口を代表しています (1、5)。 成人に向けてより安全に成長するためには、この集団を優先して、彼らの健康を確保し、SSA の発展に貢献する革新的な治療戦略を探求する必要があります。

ART の利点は疑いの余地がありませんが、現在の治療戦略には限界があります。 注目すべきは、現在のARTの生涯にわたる性質は、ほとんどの患者にとってアドヒアランスに関連した課題を伴うものであり、ARTに起因する毒性と持続する免疫機能不全は重大な健康障害を引き起こし、ARTの経験が最も多いSSA諸国を中心にHIV薬剤耐性（HIVDR）が増加していることである。患者は生きています(8)。 HIVDR と既存の抗レトロウイルス薬によって引き起こされる、新たな HIV 流行の出現の脅威があります。 これらの課題は、ART の選択肢が限られていること、製剤が不十分であること、思春期に向けて成長するにつれてアドヒアランス違反が増加していることなどから、小児集団に特に当てはまります。 これらの課題には、特に最も脆弱な集団（すなわち、 ADLHIV）（7、9）。

アイデアやモデル、仮説などのプロジェクトの基礎となる概念 HIV-1 寛解または根絶戦略は、抗レトロウイルス療法 (ART) なしでウイルス寛解を達成することを目的としています。 HIV-1 の治療法の開発は、潜在的な病原菌の存在により依然として困難です。 HIV-1 潜在貯蔵庫 (LR) は、活性化後に感染性ビリオンを産生できる、転写サイレントなプロウイルス DNA を保有する細胞の一部として定義できます (10)。 休止記憶 CD4T 細胞は LR の主な宿主ですが、共受容体の発現が低く、逆転写に対する固有の制限があるため、これらの細胞への HIV-1 感染は非効率的です (11、12)。 それにもかかわらず、HIV-1 が休止状態の CD4T 細胞に直接または細胞間感染を介して感染できるという証拠はありますが、これらの細胞への感染は複製速度の低下と関連しています (13)。 あるいは、感染して活性化された CD4T 細胞のサブセットが休止記憶表現型に戻り、プロウイルス DNA を長期維持しながらウイルス遺伝子発現を効果的に沈黙させるときに潜伏期間が確立されます(14)。 プロウイルスは、エピジェネティックな抑制、NF-κB などの転写因子の枯渇、発現遺伝子への組み込みによる転写干渉などの宿主因子を介して、これらの細胞内で静止状態に維持されます。詳細は (15) にまとめられています。 ART 中止後の LR からのウイルスのリバウンドは急速であり、治療中断から数週間以内に検出可能なウイルス血症を引き起こします (16)。 さらに、感染初期にARTを開始するだけではLRの形成を止めるのに十分ではなく、LRが早期に確立され、播種されることが示唆されている（Chun et al., 1998; Whitney et al., 2014; Colby et al., 2018）。出生後すぐにARTを開始した垂直感染した小児での発生(17)。 潜伏性リザーバーは、長年にわたるART抑制にもかかわらず安定しており、治療中断後のリバウンドウイルス血症の原因となります。 したがって、潜伏感染細胞は HIV-1 治癒の主な障壁となるため、新たな治療および根絶戦略の対象となるべきです。

HIV-1 の機能的治療法や殺菌治療法の開発に向けた進歩は、LR の存在によって大幅に妨げられてきました。 現在、2人がHIV-1感染症から治癒しており、いわゆるベルリン患者とロンドン患者は、CCR5?32/?32ドナーから同種幹細胞移植を受けて以来、10歳以上と2歳以上のウイルスリバウンド検査で一貫して陰性を示している。それぞれ、ART なしの場合 (18)。 これらの場合、感染細胞プールは移植前条件付け中に大幅に枯渇し、CCR5 共受容体の大きな欠失により R5 指向性ウイルスの感染に耐性のあるドナー細胞に置き換えられました (19)。 CCR5 ?32/?32 ドナーの相対的な不足と、これらの症例を決定づける特殊な状況のため、このタイプの治療法は広範囲に使用することは不可能ですが、HIV-1 治療の基本原理を強調しています。 HIV-1 LRを沈黙させるか根絶する(20)。 過去 10 年にわたり、ART 治療を受けている患者のどこで、どのように HIV が存続するかについての理解は、ウイルスが複数の細胞型と組織部位、および休止期および増殖中の長命潜伏感染細胞の両方で存続するという証拠によって大幅に変化しました。 したがって、抑制治療の枠組みにおいて、ウイルス保有者の正確な推定はウイルスの持続性をよりよく把握するのに役立ち、ひいては治癒を達成するための既存の障壁を克服する可能性がある(21)。

総 HIV DNA は、組み込まれた HIV DNA と組み込まれていない HIV DNA の両方を含む参照バイオマーカーであり、ウイルス保有者の世界レベルを反映します。 重要なのは、Buzon ら。は、初期感染で最初に治療を受けた成人コホートにおける、HIV 感染から治療開始までの時間と 10 年間の継続治療後の総 HIV DNA レベルとの間の統計的相関関係を報告しました (22)。 小児では、1 歳未満でウイルス制御が達成された場合、HIV DNA レベルが著しく低下しました (23)。 他のマーカーと比較すると、総 HIV DNA には、デジタル ドロップレット PCR (ddPCR) を含む、標準化された高感度のリアルタイム PCR による定量が容易であるという利点があります (24)。

全身的な免疫活性化は HIV-1 感染の特徴です。 この状態では、さまざまな免疫細胞が活性化、増殖、アポトーシスマーカーの発現の増加、細胞周期制御の異常を伴う細胞代謝回転、炎症誘発性サイトカインの産生、リンパ組織の線維化の増加を示します(25)。 免疫活性化は HIV-1 疾患の進行と強く関連しています。例えば、CD38 および HLA-DR の発現によって測定される T 細胞活性化は、血漿ウイルス量よりも CD4+T 細胞枯渇と生存期間の短縮を予測します (26、27)。 さらに、CD8+T 細胞活性化によって測定される HIV-1 感染初期の免疫活性化レベルは、血漿 HIV-1 RNA レベルとは無関係に CD4+T 細胞喪失を予測します (28)。 効果的な抗レトロウイルス治療 (ART) によるウイルス複製の抑制は免疫活性化を低下させますが、効果的な ART レジメンでさえ、HIV 感染者の免疫活性化レベルを健康な人に見られるレベルまで下げることはできません (25)。 HIV に感染した小児は、たとえ ART による治療が成功したとしても、生涯にわたり免疫活性化の上昇に直面することになります。 したがって、慢性的な免疫活性化と炎症が免疫系の発達と小児 HIV 感染症の疾患転帰に及ぼす潜在的な影響を評価することは、特に重要です。 最近の研究では、免疫活性化 (HLA-DR、CD38) および消耗マーカー (Tim-3、PD-1、Lag-3) が、ART 治療を受けた成人のリザーバーサイズと強く関連していることが示されており、したがって、ウイルスの感染を最小限に抑えることが期待される可能性があります。初期のARTによるリザーバーは、同様に、免疫活性化のレベルと、持続的な免疫活性化に関連する非エイズ「老化」疾患のレベルを最小限に抑える可能性があります。

循環する HIV-1 株と HIV-2 株の変動が最も大きい地理的環境である西および中央アフリカ地域の HIV 保有源を特徴付ける証拠は限られています (29、30)。 例えば、HIV-1の人獣共通感染症の中心地であるカメルーンは、ほとんどのグループM（サブ）サブタイプ、膨大な数のURFおよびCRF、およびグループNを含む、CRF02_AG組換え体によって引き起こされる広範に多様なHIVの状況のホストとなっている。 O、P、および HIV-2 ウイルス (31-33)。 したがって、カメルーンのような環境において、いくつかの HIV クレードにわたるウイルス保有者の遺伝子型および定量的プロファイルに関するベースライン データを生成することは、HIV 治療のための最適な戦略の設計に役立つでしょう。 前述の垂直感染に対する青少年の脆弱性と、この集団におけるウイルス保有者および免疫活性化/炎症反応に関する知識が限られていることを考慮すると、この標的から得られる証拠は現在の世界的な取り組みを非常に補完するものとなるでしょう。 このような証拠は、重度の重感染の状況下で得られたものであり(34, 35)、世界の他の地域で報告されているものとは大きく異なるHIV持続のメカニズムを描写している可能性がある。

予備作業：

進行中のEDCTP READY-Studyの枠組みの中で、我々はカメルーンでARTを受けている垂直感染した青少年（10～19歳）292人のコホートを設定した。 このコホートでは、中央値8年間のART後の検出不能なウイルス量（<40コピー/mL）率が40％、免疫不全（CD4<250細胞/mm3）率が約20％、臨床的失敗率が10％未満であることを報告した。失敗（すなわち、 WHO ステージ III/IV) (36)。 この集団は、リザーバーのサイズと性質、免疫応答/サイトカインプロファイリングの変動性、ウイルスのサブタイプ、治療歴（ARTレジメンと期間）、性差、および感染症の管理に対する遵守レベルの影響を理解するためのユニークな機会を提供します。ウイルスの貯蔵庫。

標的：

この研究の目的は、カメルーンで抗レトロウイルス療法を受けている垂直感染青年のウイルス学的および免疫学的プロファイルに従って、HIV 保有者とその変動性を特徴づけることであり、それによってウイルス保有者についての理解を深め、HIV 治療研究に正確で信頼できるデータを提供することです。

具体的な目的:

この研究では、次のことを行います。 1- 細胞のリザーバーにおける HIV-1 の遺伝的多様性と薬剤耐性を決定する。 2- HIV-1 に垂直感染した青年における免疫活性化/炎症を特徴付ける。 3- HIV 保有者のサイズを評価します。 4- ウイルス保有者プロファイルに対する抗レトロウイルス療法と免疫応答の効果を評価します。

材料と方法 研究デザイン 私たちは、カメルーンで HIV とともに暮らし、ART を受けている青少年を対象とした観察および比較研究を実施する予定です。 参加者は、EDCTP-READY研究のために募集された垂直感染した青少年300人近くの既存コホートから選択され登録される。

EDCTP-READY-研究の主な目的は、カメルーンにおける一次および二次抗レトロウイルス療法を受けている青少年の治療反応、薬剤耐性、およびHIV-1の変動を評価することでした(7)。 この研究では、296 人の HIV+ 青年を募集し、循環 RNA における HIV-1 遺伝子型プロファイルを比較しました。 30% (89/296) の APHI のうち、ウイルス学的失敗 (VL>1000 コピー/mL) が発生しました。

サンプリング方法:

血液サンプルは、適格基準に従って EDCTP-READY 研究の参加者から収集されます。

適格基準：

対象基準：研究に登録されるのは、垂直感染した10～19歳のHIV陽性青少年で、少なくとも12か月ARTを受けており、書面による同意を提供し、法的保護者が書面による代理同意を提供する。

非対象基準: ART 歴が不完全な HIV+ 青年、HBV/HCV およびマラリアの重感染者は登録対象として考慮されません。

除外基準：同意を与えた後、または血液サンプルを提供できなかった後に自由に辞退することを決定した参加者は、研究から除外されたとみなされます。

サンプルサイズ: 研究の最小サンプルサイズ (N) は、次の式に基づいて計算された参加者 90 人です: N=p (1-p) (Zα2/α2)。 N = 0.02(1-0.02) (1.962/0.052) = アームあたり 30 (アーム A: VL < 40 コピー/mL; アーム B: VL 40 ～ 999 コピー/mL; アーム C: ウイルス量 ≥1000 コピー/mL)。 P はカメルーンにおける HIV とともに生きる青少年の有病率であり、P=2% [3]。リスクであるαは、α = 5%と一致します。 Zα は、Zα = 1.96 との小さなギャップです。

注: 30 人の HIV 陰性青年のグループが免疫学的プロファイリングの対照として機能します。

すべての参加者には新しい識別番号が割り当てられ、データは HIV/AIDS の予防と管理に関する研究のために、国際参照センター シャンタル ビヤ (CIRCB) のパスワードで保護されたコンピューターに集中管理されます。

研究手順と変数 手順とタイムライン 本研究は完了までに 18 ヶ月かかります: 投与と倫理承認に 3 ヶ月 (1 ～ 3 ヶ月)、参加者の登録、サンプリングと臨床検査に 12 ヶ月 (4 ～ 15 ヶ月)、3データ処理とレポートの対象となる月 (月 16 ～ 18)。詳細については、ガント チャートを参照してください。

包含基準に基づいて、EDCTP-READY 研究から HIV+ の若者の症例報告フォームが選択され、法的保護者に連絡されます。 同意および代理によるインフォームド・コンセントは、それぞれ青少年および法的保護者から取得されます。 EDCTP-READY 研究への登録期間中、社会人口統計、臨床データ、ART 歴が再度評価されます。 次に、90 人以上の HIV+ 青年 [アームあたり 30 人 (アーム A: VL < 40 コピー/mL、アーム B: VL 40 ～ 999 コピー/mL、アーム C: ウイルス量 ≥1000 コピー/mL)] が登録されます。 。 免疫学的プロファイリングの対照として、HIV 陰性の青少年 30 人のグループが登録されます。 静脈血 (5ml x 2) は、PBMC の分離、血漿および軟膜の分離、CD4/CD8 数、血漿ウイルス量 (PVL)、免疫活性化 / 炎症マーカーの評価、HIV-RNA およびHIV-DNA ジェノタイピング、ウイルス保有者の定量化。

HIV 陰性の参加者は CIRCB で募集されます。この機関は 2006 年以来 HIV 感染者の管理のためのリファレンス センターであり、HIV 検査のリファレンス センターとして有名です。 この利点に基づいて、CIRCB は毎年いくつかの施設や地域社会を対象に無料の HIV/HBV/HCV スクリーニング検査を実施しています。そのため、近くの中等学校でも同様の無料検査キャンペーンが組織され、参加基準を満たす生徒に本研究が提供されます。 。 参加希望者は、登録のために法定後見人とともに CIRCB に招待されます。

サンプルは登録時に 1 回だけ収集され、関連するすべての社会人口統計データおよび臨床データも収集されます。 サンプルは同日に CIRCB に輸送され、PBMC の分離、DNA、血漿およびバフィーコートの分離、CD4/CD8 カウント、およびフローサイトメトリーを使用した活性化/炎症マーカーの評価が行われます。 血漿は、血漿ウイルス量（PVL）、遺伝子型決定、ELISA 検査（またはフローサイトメトリー）を使用した免疫活性化/炎症マーカー評価のために収集され、-80℃で保存されます。 その後、HIV-DNA が PBMC から抽出され、-80℃で保存されます。 HIV-DNA は、HIV ウイルス保有量の定量化のために、イタリア、ローマのローマ大学トル・ヴェルガータ実験医学科に 3 か月ごとに発送されます (付録セクションの協力書を参照)。

実験室手順 CD4/CD8 カウント: CD4/CD8 測定は、前述したようにフローサイトメトリー装置を使用して決定されます (37)。

血漿ウイルス量: 血漿ウイルス量は、前述のように m 2000rt Abbott リアルタイム システムを使用して測定されます (38)。

HIV-RNA 抽出: ARN は、製造元の説明に従って Qiamp ウイルス RNA Mini Kit (Qiagen) を使用して血漿サンプルから抽出されます。

バフィーコートからのプロウイルス DNA 抽出: プロウイルス DNA は、メーカーの説明に従って DNeasy 血液および組織抽出キット (Qiagen) を使用して抽出されます。

PBMC の分離: PBMC は、社内プロトコールを使用して Ficoll を使用した密度勾配遠心分離によって分離されます。

ＰＢＭＣからのＨＩＶ－ＤＮＡ抽出：ＨＩＶ－ＤＮＡは、製造業者の説明に従ってＱＩＡｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出される。

HIV-1 遺伝子の増幅と配列決定: HIV-1 薬剤耐性検査のためのサンガー配列決定は、我々の研究グループが以前に説明したように、ウイルス学的失敗を経験している青少年を対象に社内プロトコルで実施されます(39)。 逆転写酵素 DNA 配列は、スタンフォード大学データベースの遺伝子型耐性解釈アルゴリズム (www.stanford.edu) を使用して、薬剤耐性変異について分析されます。

系統解析: 近隣結合系統樹は、MEGA ソフトウェア (キムラ 2 パラメーター モデル、200 ブートストラップ複製) および FigTree (40、41) を使用して作成されます。

免疫プロファイリング: 免疫活性化/炎症性サイトカイン (IL-1、IL2、IL4、IL6、IL10、IL12、および TNF-α) の両方が、市販の ELISA キットとフローサイトメトリーを使用して評価されます。

HIV ウイルス保有者の定量化: ウイルス保有者は、前述のように液滴デジタル PCR (ddPCR) を使用して定量化されます。 注目すべきことに、この定量化は、この提案の付属書に記載されている協力書簡に記載されているように、イタリアのローマにあるローマ大学トル・ヴェルガータの実験医学部門で実施されます。 UTV へのサンプル出荷前に、CIRCB と UTV の間で材料移転およびデータ共有契約が署名されます。 これは HIV-1 B サブタイプ用の社内プロトコルであり、カメルーンのサンプルから予想される HIV-1 非 B サブタイプ用に調整されます。

データ分析 研究中に収集されたデータは、SPSS ソフトウェアを使用して分析されます。 関連する要因は、さまざまなパラメーターの不偏効果に対する推定アプローチを使用して、多変量ロジスティック回帰を使用して評価されます。 データは中央値として報告されます。 ノンパラメトリック検定は正規分布していないデータに使用され、異なるグループ間の中央値の比較 (ウイルス学的成功とウイルス学的失敗) は U-Mann-Whitney 検定によって実行されます。 相関関係はスピアマン検定で作成され、0.05 未満の p 値は統計的に有意であるとみなされます。

倫理的配慮 この研究は、ヒトを対象とした医学研究の倫理原則に関するヘルシンキ宣言に従って実施されます。 人間の健康に関する研究については、カメルーン国家倫理委員会から倫理的許可が得られます。 研究に関する通知後、法的保護者から書面による代理通知が得られ、参加するHIV陽性の若者からも強制されることなく書面による同意が得られます。 プライバシーと機密性は、一意の識別子とパスワードで保護されたデータベースの使用によって確保され、許可されたスタッフのみがアクセスします。 参加者は、治験クリニックでの日常的なモニタリングに影響を与えることなく、いつでも自由に治験から意図的に離脱することができます。 瀉血は非侵襲的（静脈穿刺）で、訓練を受けた看護師によって行われます。

品質保証：

私たちの研究チームには、研究プロトコルのすべての SOP に責任を負い、研究全体を通じて習熟度テストとデータ検証を管理する品質保証担当者が含まれます。

潜在的なリスクの管理: ボランティアが受ける唯一の処置は瀉血医または医師による静脈穿刺であるため、患者へのリスクは最小限です。 静脈穿刺はわずかに痛みを伴う場合がありますが、合併症の危険はほとんどありません。 対象者に対する潜在的なリスクとしては、どれも発生する可能性は低いものの、瞬間的な痛み、その部位の打撲傷、感染の可能性（ただし、非常に可能性は低い）などが挙げられます。 このような合併症が発生した場合、参加者には緊急治療が提供されます。