Karakterisering af HIV-1-reservoirer hos HIV-1-ikke-B-inficerede unge på ART i Cameroun (AVIR)

Titel: Karakterisering af virale reservoirer blandt HIV-1 non-B vertikalt inficerede unge, der modtager antiretroviral terapi i Cameroun.

Akronym: AVIR-studie, Adolescent viralt reservoir

Betydning og relevans Afrika syd for Sahara (SSA) er uforholdsmæssigt ramt af hiv/aids, med tæt på 70 % af de globale epidemier. Med den højeste byrde af pædiatriske HIV-infektioner, fandt omkring ni ud af hver 10 børn, der lever med HIV, i SSA-regionen(1, 2). Unge og unge repræsenterer en stigende andel af mennesker, der lever med hiv på verdensplan. I 2019 var omkring 1,7 mio. [1,1 mio.-2,4 million] unge mellem 10 og 19 år levede med HIV på verdensplan, hvilket repræsenterer omkring 5 % af alle mennesker, der lever med HIV, omkring 1,5 millioner [1,0 - 2,1 millioner] eller 88 % af HIV-smittede unge lever i SSA. Alene i 2019 var 460.000 [260.000-680.000] unge mellem 10 og 24 år nyligt smittet med HIV, hvoraf 170.000 [53.000-340.000] var unge mellem 19 og 19 år. For at forstærke dette tyder de seneste data på, at kun 27 % af unge piger og 16 % af unge drenge i alderen 15-19 i det østlige og sydlige Afrika - den region, der er hårdest ramt af hiv - er blevet testet for hiv inden for de seneste 12 måneder og modtaget resultatet af den sidste test. Testraterne i Vest- og Centralafrika og Sydasien er endnu lavere. Hvis de nuværende tendenser fortsætter, vil flere hundrede tusinde blive hiv-positive i de kommende år, og uden at kende deres status vil unge gå glip af livreddende behandling. Derudover er en stor population af børn inficeret med HIV perinatalt i løbet af det sidste årti vokset ind i teenageårene (3). Af de anslåede 690.000 mennesker, der døde af AIDS-relaterede sygdomme i 2019, var 110.000 (eller cirka 16%) af dem børn under 20 år. (UNICEF globale og regionale tendenser, juli 2020).

Med fremkomsten og skalerbarheden af ​​antiretroviral terapi (ART) er der et globalt fald i AIDS-relaterede dødsfald. Ved udgangen af ​​2019 havde 25,4 millioner mennesker adgang til antiretroviral behandling, hvilket repræsenterer 67 % af alle mennesker, der lever med hiv. Men kun 53% af børn, der lever med HIV, fik ART. Interessant nok er omkring 94 % af alle børn, der modtager ART, fra SSA (4). I denne sammenhæng med kontinuerlige nye HIV pædiatriske infektioner og stigende dækning i pædiatrisk ART vil antallet af børn, der lever med HIV, stige, hvilket tyder på en højere sandsynlighed for at nå teenageralderen og endda voksenalderen, hvis behandlingsregimerne forbliver fuldt effektive til at kontrollere HIV-infektion (3, 4). ADLHIV udgør derfor en HIV-population med stigende sundhedsproblemer og med meget begrænsede resultater for generaliserbare bedste praksisser, der er specifikke for denne målgruppe, især i SSA.

Ligesom flere vest- og centralafrikanske lande står Cameroun stadig over for en generaliseret HIV-epidemiologi (2,7 % prævalens) (5), med højere prævalens blandt gravide kvinder (5,7 %) og HIV-eksponerede spædbørn/børn (5,8 % [958/16.638) ] positivitet ved første PCR og 15 % ved slutningen af ​​PMTCT-kaskaden) (6). Fra juni 2018 var den nationale dækning af ART 51,5 % (281.083), hvilket omfatter 12.362 børn under 15 år (6). Med hensyn til respons på ART i Cameroun rapporterede vi en samlet frekvens på 79,4 % viral undertrykkelse med betydelige forskelle på tværs af aldersgrupper: 81,1 % hos voksne, 75,6 % hos børn og kun 53,3 % hos unge i alderen 10-19 år (7). I lighed med UNAIDS-rapporter repræsenterer unge, der lever med HIV (ADLHIV), den mest sårbare og undertjente befolkning som reaktion på epidemierne(1, 5). For en sikrere vækst mod voksenlivet er der behov for at prioritere denne befolkningsgruppe for søgen efter innovative behandlingsstrategier, der sikrer deres velvære og deres bidrag til udviklingen af ​​SSA.

På trods af de ubestridte fordele ved ART, er der begrænsninger med de nuværende behandlingsstrategier. Det er værd at bemærke, at den livslange karakter af nuværende ART går med udfordringer relateret til overholdelse for de fleste patienter, ART-tilskrevne toksiciteter og vedvarende immundysfunktion har betydelige sundhedsmæssige svækkelser, og HIV-lægemiddelresistens (HIVDR) er stigende, mest i SSA-lande, hvor de fleste ART-erfarne patienter er i live (8). Der er en trussel om en ny HIV-epidemi på vej, drevet af HIVDR til eksisterende antiretrovirale midler. Disse udfordringer gælder især for pædiatriske populationer på grund af begrænsede ART-muligheder, dårlige lægemiddelformuleringer og stigende hændelser af manglende overholdelse, efterhånden som de vokser hen imod teenageårene. Disse udfordringer kræver tilgange til HIV (funktionel) helbredelse eller remission, især for de mest sårbare befolkningsgrupper (dvs. ADLHIV) (7, 9).

Koncepter, der understøtter projektet, herunder ideer og modeller eller antagelser HIV-1-remission eller udryddelsesstrategier sigter mod at opnå viral remission i fravær af antiretroviral terapi (ART). Udviklingen af ​​en HIV-1-kur er fortsat udfordrende på grund af de latente reservoirer. HIV-1 Latent Reservoir (LR) kan defineres som den fraktion af celler, der huser transkriptionelt tavt proviralt DNA, som er i stand til at producere infektiøse virioner efter aktivering(10). Hvilende hukommelse CD4T-celler er den primære vært for LR, men HIV-1-infektion i disse celler er ineffektiv på grund af deres lave co-receptorekspression og iboende restriktioner for revers transkription (11, 12). Ikke desto mindre er der evidens for, at HIV-1 kan inficere hvilende CD4T-celler direkte eller via celle-til-celle transmission, selvom infektion i disse celler er forbundet med langsommere replikationskinetik (13). Alternativt etableres latens, når en undergruppe af inficerede, aktiverede CD4T-celler vender tilbage til en hvilende hukommelsesfænotype, hvilket effektivt dæmper viral genekspression, samtidig med at det provirale DNA opretholdes på lang sigt(14). Proviruset holdes i en hvilende tilstand i disse celler via værtsfaktorer såsom epigenetisk suppression, udtømning af transkriptionsfaktorer såsom NF-KB og transkriptionel interferens på grund af integration i udtrykte gener, gennemgået mere detaljeret (15). Viral rebound fra LR efter ophør med ART er hurtig, hvilket fører til påviselig viræmi inden for uger efter behandlingsafbrydelse (16). Derudover er initiering af ART tidligt i infektion ikke tilstrækkelig til at stoppe dannelsen af ​​LR, hvilket tyder på, at LR etableres og spredes tidligt (Chun et al., 1998; Whitney et al., 2014; Colby et al., 2018), selv hos vertikalt inficerede børn, der startede med ART kort efter fødslen (17). Det latente reservoir er stabilt på trods af mange års suppressiv ART og er kilden til rebound-viræmi efter behandlingsafbrydelse. Latent inficerede celler repræsenterer derfor den vigtigste barriere for en HIV-1-kur og bør målrettes specifikt af nye behandlings- og udryddelsesstrategier.

Fremskridtet hen imod udviklingen af ​​en funktionel eller steriliserende kur mod HIV-1 er blevet væsentligt hæmmet af tilstedeværelsen af ​​LR. I øjeblikket er to personer blevet helbredt for HIV-1-infektion, de såkaldte Berlin- og London-patienter, som siden de modtog allogene stamcelletransplantationer fra CCR5?32/?32-donorer, konsekvent er testet negativ for viral rebound i over 10 og 2 gange. år uden ART (18). I disse tilfælde var den inficerede cellepulje signifikant udtømt under prætransplantationskonditionering og erstattet med donorceller, der er resistente over for infektion med R5-tropisk virus på grund af en stor deletion i CCR5 co-receptoren (19). På grund af den relative mangel på CCR5 ?32/?32-donorer og de unikke omstændigheder, der forudbestemmer disse tilfælde, er denne type kur ikke mulig til udbredt brug, den understreger dog det grundlæggende princip for HIV-1-kur; dæmpe eller udrydde HIV-1 LR (20). I løbet af det sidste årti har forståelsen af, hvor og hvordan HIV fortsætter hos individer på ART, transformeret sig væsentligt med beviser for, at virus persisterer i flere celletyper og vævssteder, og i både hvilende og prolifererende langlivede latent inficerede celler. Inden for rammerne af en undertrykkende behandling vil nøjagtige estimater af det virale reservoir således hjælpe med en bedre mestring af viral persistens, hvilket igen kan overvinde eksisterende barrierer for at opnå en helbredelse(21).

Total HIV DNA er en reference biomarkør, der inkluderer både integreret og uintegreret HIV DNA og afspejler det globale niveau af det virale reservoir. Det er vigtigt, at Buzon et al. rapporterede en statistisk sammenhæng mellem tiden fra HIV-infektion til behandlingsstart og det samlede HIV-DNA-niveau efter 10 års kontinuerlig behandling i en kohorte af voksne, der først blev behandlet med tidlig infektion (22). Hos børn var HIV-DNA-niveauet markant lavere, når viral kontrol blev opnået før 1 års alderen (23). I sammenligning med andre markører har total HIV-DNA fordelen af ​​nem kvantificering ved standardiseret, følsom, realtids-PCR, inklusive digital dråbe-PCR (ddPCR) (24).

Generaliseret immunaktivering er et kendetegn for HIV-1-infektion. I denne tilstand viser en række immunceller en stigning i ekspression af aktivering, proliferation og apoptotiske markører, cellulær omsætning med afvigende cellecyklusregulering, produktion af pro-inflammatoriske cytokiner og øget lymfoid vævsfibrose (25). Immunaktivering er stærkt forbundet med HIV-1 sygdomsprogression; for eksempel er T-celleaktivering, målt ved ekspression af CD38 og HLA-DR, mere forudsigelig for CD4+T-celleudtømning og kortere overlevelse end plasmavirusbelastningen (26, 27). Endvidere forudsiger niveauet af immunaktivering tidligt i HIV-1-infektion målt ved CD8+T-celleaktivering CD4+T-celletab uafhængigt af plasma HIV-1 RNA-niveauer (28). Undertrykkelse af viral replikation med effektiv antiretroviral behandling (ART) reducerer immunaktivering, men selv effektive ART-regimer er ikke i stand til at reducere niveauerne af immunaktivering hos HIV-inficerede personer til niveauer, der ses hos raske personer (25). HIV-inficerede børn, selvom de med succes behandles med ART, står over for et helt liv med forhøjet immunaktivering. Evaluering af den potentielle indvirkning af kronisk immunaktivering og -inflammation på det udviklende immunsystem og på sygdomsudfald ved pædiatrisk HIV-infektion er derfor af særlig betydning. Nylige undersøgelser viste, at immunaktivering (HLA-DR, CD38) og udmattelsesmarkører (Tim-3, PD-1, Lag-3) er stærkt forbundet med reservoirstørrelse hos ART-behandlede voksne, og det kan derfor forventes, at minimering af viral reservoir med tidlig ART kan på samme måde minimere niveauet af immunaktivering og de ikke-AIDS 'aldrende' sygdomme forbundet med vedvarende immunaktivering.

Der er begrænset evidens for karakterisering af HIV-reservoirer i Vest- og Centralafrikanske regioner, en geografisk indstilling med den største variation i cirkulerende HIV-1- og HIV-2-stammer (29, 30). For eksempel er Cameroun, et zoonotisk epicenter af HIV-1, vært for et vidt forskelligt landskab af HIV drevet af CRF02_AG rekombinanten, herunder de fleste gruppe M (under-) subtyper, en bred vifte af URF'er og CRF'er og gruppe N, O-, P- og HIV-2-vira (31-33). Generering af basislinjedata om den genotypiske og kvantitative profil af det virale reservoir på tværs af adskillige HIV-klader i omgivelser som Cameroun ville således informere udformningen af ​​optimale strategier for HIV-kur. I betragtning af den førnævnte sårbarhed hos unge med vertikal infektion og den begrænsede viden om virale reservoirer og immunaktivering/inflammatorisk reaktion i denne population, vil beviser genereret fra dette mål i høj grad være komplementære til den nuværende globale indsats. Sådanne beviser, genereret i en sammenhæng med høj byrde af co-infektioner (34, 35), kan skildre forskellige mekanismer for hiv-persistens langt fra dem, der er rapporteret i andre dele af verden.

Indledende arbejde:

Inden for rammerne af det igangværende EDCTP READY-studie har vi oprettet en kohorte på 292 vertikalt inficerede unge (10-19 år), der modtager ART i Cameroun. I denne kohorte rapporterede vi en rate på 40 % uopdagelig viral belastning (<40 kopier/ml) efter en median på 8 års ART, omkring 20 % immunologisk svigt (CD4<250 celler/mm3) og mindre end 10 % klinisk fiasko (dvs. WHO trin III/IV) (36). Denne population giver en unik mulighed for at forstå størrelsen og arten af ​​reservoiret, variabiliteten af ​​immunrespons/cytokinprofilering og virkningen af ​​viral subtype, behandlingshistorie (ART-regime og varighed), kønsforskelle og adhærensniveau på kontrollen af viralt reservoir.

SIGTE:

Formålet med denne undersøgelse er at karakterisere HIV-reservoirer og deres variabilitet i henhold til virologiske og immunologiske profiler af vertikalt inficerede unge, der modtager antiretroviral behandling i Cameroun, og derfor forbedre forståelsen af ​​virale reservoirer og levere nøjagtige og pålidelige data til HIV-kurforskning.

Specifikke mål:

I denne undersøgelse skal vi: 1- Bestemme HIV-1 genetisk variabilitet og lægemiddelresistens i cellulære reservoirer; 2- Karakteriser immunaktivering/-inflammation hos unge, der er vertikalt inficeret med HIV-1; 3- Evaluer størrelsen af ​​HIV-reservoiret; 4- Evaluer effekten af ​​antiretroviral terapi og immunrespons på den virale reservoirprofil.

Materialer og metoder Undersøgelsesdesign Vi planlægger at udføre en observationel og komparativ undersøgelse blandt unge, der lever med HIV og modtager ART i Cameroun. Deltagerne vil blive udvalgt og tilmeldt fra en eksisterende kohorte på tæt på 300 vertikalt inficerede teenagere rekrutteret til EDCTP-READY undersøgelsen.

Hovedformålet med EDCTP-READY-studiet var at evaluere behandlingsrespons, lægemiddelresistens og HIV-1-variabilitet blandt unge i første- og andenlinjes antiretroviral behandling i Cameroun (7). I denne undersøgelse rekrutterede vi 296 HIV+ teenagere og sammenlignede den HIV-1 genotypiske profil i cirkulerende RNA. Ud af 30 % (89/296) APHI oplever virologisk svigt (VL>1000 kopier/ml).

Prøveudtagningsmetode:

Blodprøver vil blive indsamlet fra deltagere i EDCTP-READY-undersøgelsen i henhold til berettigelseskriterierne.

Berettigelseskriterier:

Inklusionskriterier: Vil blive tilmeldt undersøgelsen, HIV+-unge i alderen 10-19 år, vertikalt inficerede, har været på ART i mindst 12 måneder, som giver deres skriftlige samtykke, og hvis juridiske værge giver skriftlig fuldmagtssamtykke.

Ikke-inklusionskriterier: Vil ikke komme i betragtning til tilmelding, HIV+-ungdom med ufuldstændig ART-historie, HBV/HCV- og malaria-coinfektioner.

Eksklusionskriterier: Vil blive betragtet som udelukket fra undersøgelsen, enhver deltager, der beslutter sig frit for at trække sig efter at have givet samtykke eller ude af stand til at afgive blodprøve.

Prøvestørrelse: Minimumsprøvestørrelsen (N) for undersøgelsen er 90 deltagere, beregnet ud fra følgende formel: N=p (1-p) (Zα2/α2); N = 0,02(1-0,02) (1,962/0,052) = 30 pr. arm (arm-A: VL<40 kopier/ml; arm-B: VL 40-999 kopier/ml; arm-C: viral belastning ≥1000 kopier/ml). P er prævalensen af ​​unge, der lever med HIV i Cameroun med P=2% [3]; α er risikoen, stemmer overens med α = 5 %; Zα er det lille mellemrum med Za = 1,96.

NB: En gruppe på 30 HIV-negative unge vil fungere som kontrol for immunologisk profilering.

Alle deltagere vil blive tildelt et nyt identifikationsnummer, og data vil blive centraliseret i en adgangskodebeskyttet computer på det internationale referencecenter Chantal Biya (CIRCB) til forskning i HIV/AIDS-forebyggelse og -håndtering.

Undersøgelsesprocedurer og variabler Procedurer og tidslinjer Nærværende undersøgelse kræver 18 måneder for at blive gennemført: 3 måneder (måned 1-3) til administration og etisk godkendelse, 12 måneder (måned 4 til 15) til tilmelding af deltagere, prøveudtagning og laboratorieanalyser, 3 måneder (måned 16 til 18) for databehandling og rapportering, se Gantt-diagrammet for flere detaljer.

Baseret på inklusionskriterier vil case-rapportformularer for HIV+-unger blive udvalgt fra EDCTP-READY-undersøgelsen, og deres juridiske værge vil blive kontaktet. Samtykke og fuldmagtsinformeret samtykke vil blive indhentet fra henholdsvis unge og værge. Sociodemografiske, kliniske data og ART-historie vil blive vurderet igen for perioden under optagelse i EDCTP-READY-studiet. Derefter vil 90 eller flere HIV+ teenagere [30 pr. arm (arm-A: VL<40 kopier/ml; arm-B: VL 40-999 kopier/ml; arm-C: viral load ≥1000 kopier/ml)] blive tilmeldt . En gruppe på 30 HIV-negative teenagere vil blive tilmeldt til at fungere som kontrol for immunologisk profilering. Intravenøst ​​blod (5 ml x 2) vil blive indsamlet af en uddannet phlebotomist til laboratorieanalyser, herunder PBMC'er isolering, plasma og buffy coat isolering, CD4/CD8 tællinger, plasmatisk viral load (PVL), immunaktivering/inflammatoriske markører vurdering, HIV-RNA og HIV-DNA genotypebestemmelse, kvantificering af virale reservoirer.

HIV-negative deltagere vil blive rekrutteret på CIRCB, denne institution er et referencecenter for håndtering af HIV-smittede personer siden 2006, og er som sådan et kendt referencecenter for HIV-testning. Baseret på denne fordel organiserer CIRCB gratis HIV/HBV/HCV-screeningstest for flere institutioner og lokalsamfund om året, derfor vil en lignende gratis testkampagne blive organiseret i en nærliggende gymnasieskole, og denne undersøgelse vil blive præsenteret for dem, der opfylder inklusionskriterierne . Potentielle deltagere vil blive inviteret på CIRCB med deres juridiske værge til tilmelding.

Der vil kun blive indsamlet prøver én gang ved tilmeldingen samt alle relevante sociodemografiske og kliniske data. Prøver vil blive transporteret til CIRCB samme dag til PBMCs isolering, DNA, plasma og buffy coat isolering, CD4/CD8 tællinger og aktiverings/inflammatoriske markører vurdering ved hjælp af flowcytometri. Plasma vil blive opsamlet og opbevaret ved -80oC til plasmatisk viral belastning (PVL), genotypebestemmelse, immunaktivering/inflammatoriske markører vurdering ved hjælp af ELISA-test (eller flowcytometri). HIV-DNA vil efterfølgende blive ekstraheret fra PBMC'er og opbevaret ved -80oC; HIV-DNA vil blive sendt hver tredje måned til afdelingen for eksperimentel medicin, Universitetet i Rom Tor Vergata, Rom, Italien, for kvantificering af HIV-viral reservoir (se brev om samarbejde i bilaget).

Laboratorieprocedurer CD4/CD8-tal: CD4/CD8-målinger vil blive bestemt ved hjælp af flowcytometrimaskine som tidligere beskrevet (37).

Plasma viral load: Plasma viral load vil blive bestemt ved at bruge m 2000rt Abbott realtidssystem som tidligere beskrevet (38).

HIV-RNA-ekstraktion: ARN vil blive ekstraheret fra plasmaprøver ved hjælp af Qiamp viral RNA Mini Kit (Qiagen) som beskrevet af producenten.

Pro-viral DNA-ekstraktion fra buffy coat: Pro-viral DNA vil blive ekstraheret ved hjælp af DNeasy blod- og vævsekstraktionssæt (Qiagen) som beskrevet af producenten.

PBMC-isolering: PBMC'er vil blive isoleret ved densitetsgradientcentrifugering ved hjælp af Ficoll ved hjælp af en intern protokol.

HIV-DNA-ekstraktion fra PBMC'er: HIV-DNA vil blive ekstraheret ved hjælp af QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen) som beskrevet af producenten.

HIV-1 gener amplifikation og sekventering: Sanger-sekventering til HIV-1 lægemiddelresistenstestning vil blive udført for unge, der oplever virologisk svigt, en intern protokol, som tidligere beskrevet af vores forskergruppe(39). Revers transkriptase-DNA-sekvenser vil blive analyseret for lægemiddelresistensmutationer ved hjælp af Stanford Universitys database genotypisk resistensfortolkningsalgoritme (www.stanford.edu).

Fylogenetisk analyse: Naboforbindelses-fylogenetiske træer vil blive skabt ved hjælp af MEGA-software (Kimura 2-parameter model, 200 bootstrap-replikationer) og FigTree (40, 41).

Immunprofilering: Både immunaktivering/inflammatoriske cytokiner (IL-1, IL2,IL4, IL6, IL10, IL12 og TNF-alpha) vil blive vurderet ved hjælp af kommercielle ELISA-sæt og flowcytometri.

Kvantificering af HIV virale reservoirer: virale reservoirer vil blive kvantificeret ved hjælp af dråbe digital PCR (ddPCR) som tidligere beskrevet. Det skal bemærkes, at denne kvantificering vil blive udført i afdelingen for eksperimentel medicin, Universitetet i Rom Tor Vergata, Rom, Italien som angivet i samarbejdsbrevet i bilaget til dette forslag. En materialeoverførsel og en datadelingsaftale vil blive underskrevet mellem CIRCB og UTV før prøveforsendelse til UTV. Det er en intern protokol for HIV-1 B-subtype og vil blive justeret for HIV-1 non-B-subtyper, der forventes fra Camerounske prøver.

Dataanalyse Data indsamlet under undersøgelsen vil blive analyseret ved hjælp af SPSS-software. Tilknyttede faktorer vil blive evalueret ved hjælp af multivariat logistisk regression, med en estimattilgang for den objektive effekt af forskellige parametre. Dataene vil blive rapporteret som median. Ikke-parametriske tests vil blive brugt for data, der ikke er normalfordelt, sammenligninger af medianer mellem forskellige grupper (virologisk succes vs virologisk svigt) vil blive udført ved U-Mann-Whitney testen. Korrelationer vil blive lavet med Spearman-testen, og p-værdier mindre end 0,05 vil blive anset for at være statistisk signifikante.

Etiske overvejelser Denne undersøgelse vil blive udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen om etiske principper for medicinsk forskning, der involverer mennesker. Etisk godkendelse vil blive opnået fra Cameroun National Ethics Committee for forskning i menneskers sundhed. efter en informeret meddelelse om undersøgelsen, vil der blive indhentet en skriftlig fuldmægtig-informeret fra værge, og en skriftlig tilladelse vil også blive indhentet fra den deltagende HIV+ teenager, uden nogen form for tvang. Privatliv og fortrolighed vil blive sikret gennem brug af unikke identifikatorer og en adgangskodebeskyttet database og vil kun blive tilgået af autoriseret personale. Deltagerne vil være frie til bevidst at forlade undersøgelsen til enhver tid uden nogen indflydelse på deres rutinemæssige overvågning på undersøgelsesklinikken. Flebotomi vil være non-invasiv (venepunktur) og vil blive udført af en uddannet sygeplejerske.

Kvalitetssikring:

Vores undersøgelsesteam vil omfatte en kvalitetssikringsmedarbejder, som vil være ansvarlig for alle SOP'er for undersøgelsesprotokollen og vil styre færdighedstest og datavalidering under hele undersøgelsen.

Håndtering af potentielle risici: Risiciene for patienterne er minimale, da den eneste procedure, den frivillige udsættes for, er venepunktur af en phlebotomist eller læge. Venepunkturen kan være let smertefuld, men er praktisk talt uden risiko for komplikationer. De potentielle risici for forsøgspersoner, hvoraf ingen sandsynligvis vil forekomme, kan omfatte kortvarige smerter, blå mærker på stedet eller mulig (men yderst usandsynlig) infektion. Hvis sådanne komplikationer opstår, vil deltageren blive forsynet med akut medicinsk behandling.