Charakterizace rezervoárů HIV-1 u dospívajících neinfikovaných HIV-1 na ART v Kamerunu (AVIR)

Název: Charakterizace virových rezervoárů mezi HIV-1 non-B vertikálně infikovanými dospívajícími, kteří dostávají antiretrovirovou terapii v Kamerunu.

Zkratka: AVIR-study, Adolescent viral rezervoár

Význam a relevance Subsaharská Afrika (SSA) je neúměrně zasažena HIV/AIDS, s téměř 70 % celosvětových epidemií. S nejvyšší zátěží dětských infekcí HIV se asi devět z každých 10 dětí žijících s HIV nachází v regionu SSA (1, 2). Dospívající a mladí lidé představují celosvětově rostoucí podíl lidí žijících s HIV. V roce 2019 asi 1,7 milionu [1,1 milionu-2,4 milión] dospívajících ve věku 10 až 19 let žili s HIV na celém světě, což představuje asi 5 % všech lidí žijících s HIV, asi 1,5 miliónu [1,0 – 2,1 miliónu] neboli 88 % dospívajících infikovaných HIV žije v SSA. Jen v roce 2019 bylo HIV nově infikováno 460 000 [260 000–680 000] mladých lidí ve věku 10 až 24 let, z nichž 170 000 [53 000–340 000] byli mladiství ve věku 10 až 19 let. Nejnovější údaje naznačují, že pouze 27 % dospívajících dívek a 16 % dospívajících chlapců ve věku 15–19 let ve východní a jižní Africe – regionu nejvíce postiženém virem HIV – bylo v posledních 12 měsících testováno na HIV. výsledek posledního testu. Míra testování v západní a střední Africe a jižní Asii je ještě nižší. Pokud budou současné trendy pokračovat, statisíce dalších se v příštích letech stanou HIV pozitivními a dospívající bez znalosti svého stavu přijdou o život zachraňující léčbu. Navíc velká populace dětí infikovaných HIV perinatálně během posledního desetiletí roste do adolescence (3). Z odhadovaných 690 000 lidí, kteří v roce 2019 zemřeli na nemoci související s AIDS, 110 000 (nebo přibližně 16 %) z nich byly děti do 20 let. (Globální a regionální trendy UNICEF, červenec 2020).

S příchodem a škálovatelností antiretrovirové terapie (ART) dochází ke globálnímu poklesu úmrtí souvisejících s AIDS. Ke konci roku 2019 využívalo antiretrovirovou terapii 25,4 milionu lidí, což představuje 67 % všech lidí žijících s HIV. Pouze 53 % dětí žijících s HIV však dostávalo ART. Je zajímavé, že asi 94 % všech dětí užívajících ART pochází ze SSA (4). V tomto kontextu neustálých nových dětských infekcí HIV a rostoucího pokrytí pediatrickou ART se počet dětí žijících s HIV zvýší, což naznačuje vyšší pravděpodobnost dosažení dospívajícího věku a dokonce i dospělosti, pokud léčebné režimy zůstanou plně účinné při kontrole infekce HIV (3, 4). ADLHIV proto tvoří populaci HIV s rostoucími zdravotními problémy a s velmi omezenými výsledky zobecňujících osvědčených postupů specifických pro tuto cílovou populaci, zejména v SSA.

Stejně jako několik zemí západní a střední Afriky se Kamerun stále potýká s generalizovanou epidemiologií HIV (2,7% prevalence) (5), s vyšší prevalencí mezi těhotnými ženami (5,7 %) a kojenci/dětmi vystavenými HIV (5,8 % [958/16 638 ] pozitivita při první PCR a 15 % na konci kaskády PMTCT) (6). K červnu 2018 bylo celostátní pokrytí ART 51,5 % (281 083), což zahrnuje 12 362 dětí mladších 15 let (6). Pokud jde o odpověď na ART v Kamerunu, zaznamenali jsme celkovou míru 79,4% virové suprese s významnými rozdíly napříč věkovými rozmezími: 81,1 % u dospělých, 75,6 % u dětí a pouze 53,3 % u dospívajících ve věku 10–19 let (7). Podobně jako ve zprávách UNAIDS představují adolescenti žijící s HIV (ADLHIV) nejzranitelnější a nedostatečně zabezpečenou populaci v reakci na epidemie(1, 5). Pro bezpečnější růst směrem k dospělosti je potřeba upřednostnit tuto populaci při hledání inovativních léčebných strategií, které zajistí jejich pohodu a jejich příspěvek k rozvoji SSA.

Navzdory nezpochybnitelným přínosům ART existují omezení současných léčebných strategií. Je třeba poznamenat, že celoživotní povaha současné ART jde u většiny pacientů s problémy souvisejícími s adherencí, toxicita přisuzovaná ART a přetrvávající imunitní dysfunkce mají významné zdravotní poškození a rezistence na léky proti HIV (HIVDR) roste, většinou v zemích SSA, kde má většina ART zkušenost. pacienti žijí (8). Existuje hrozba objevující se nové epidemie HIV, kterou HIVDR zažene na stávající antiretrovirová léčiva. Tyto problémy platí zejména pro pediatrickou populaci kvůli omezeným možnostem ART, špatným lékovým formulacím a zvyšujícím se případům non-adherence, jak rostou směrem k adolescenci. Tyto výzvy vyžadují přístupy k (funkčnímu) vyléčení nebo remisi HIV, zejména u nejzranitelnějších populací (tj. ADLHIV) (7, 9).

Koncepce, na nichž je projekt založen, včetně myšlenek a modelů nebo předpokladů Strategie remise nebo eradikace HIV-1 mají za cíl dosáhnout virové remise bez antiretrovirové terapie (ART). Vývoj léku na HIV-1 zůstává náročný kvůli latentním rezervoárům. HIV-1 Latent Reservoir (LR) lze definovat jako frakci buněk nesoucích transkripčně tichou provirovou DNA, které jsou schopné po aktivaci produkovat infekční viriony(10). Klidové paměťové CD4T buňky jsou primárním hostitelem LR, ale infekce HIV-1 v těchto buňkách je neúčinná kvůli jejich nízké expresi koreceptorů a inherentním omezením reverzní transkripce (11, 12). Nicméně existují důkazy, že HIV-1 může infikovat klidové CD4T buňky přímo nebo prostřednictvím přenosu z buňky na buňku, ačkoli infekce v těchto buňkách je spojena s pomalejší kinetikou replikace (13). Alternativně je latence stanovena, když se podskupina infikovaných, aktivovaných CD4T buněk vrátí do klidového paměťového fenotypu, čímž se účinně umlčí virová genová exprese a zároveň se udrží provirová DNA dlouhodobě (14). Provirus je v těchto buňkách udržován v klidovém stavu prostřednictvím hostitelských faktorů, jako je epigenetická suprese, deplece transkripčních faktorů, jako je NF-κB, a transkripční interference v důsledku integrace do exprimovaných genů, které jsou podrobněji přezkoumány (15). Odraz viru z LR po ukončení ART je rychlý, což vede k detekovatelné virémii během týdnů po přerušení terapie [16]. Navíc zahájení ART v rané fázi infekce nestačí k zastavení tvorby LR, což naznačuje, že LR je zavedena a šířena brzy (Chun et al., 1998; Whitney et al., 2014; Colby et al., 2018), dokonce i u vertikálně infikovaných dětí, které zahájily ART brzy po narození (17). Latentní rezervoár je stabilní i přes roky supresivní ART a je zdrojem rebound virémie po přerušení terapie. Latentně infikované buňky proto představují hlavní bariéru vyléčení HIV-1 a měly by být specificky zaměřeny na nové léčebné a eradikační strategie.

Pokrok směrem k vývoji funkčního nebo sterilizačního léku na HIV-1 byl významně brzděn přítomností LR. V současné době byli z infekce HIV-1 vyléčeni dva lidé, takzvaní berlínští a londýnskí pacienti, kteří od té doby, co dostali alogenní transplantaci kmenových buněk od dárců CCR5?32/?32, byli trvale testováni na virový rebound fenomén více než 10 a 2 let. let, respektive bez ART (18). V těchto případech byl infikovaný buněčný fond během předtransplantačního kondicionování významně vyčerpán a nahrazen dárcovskými buňkami, které jsou odolné vůči infekci R5-tropním virem v důsledku velké delece v koreceptoru CCR5 (19). Vzhledem k relativnímu nedostatku dárců CCR5 a32/a32 a jedinečným okolnostem předurčujícím tyto případy není tento typ léčby proveditelný pro široké použití, zdůrazňuje však základní princip léčby HIV-1; umlčet nebo vymýtit HIV-1 LR (20). Během posledního desetiletí se pochopení toho, kde a jak HIV přetrvává u jedinců na ART, podstatně změnilo s důkazy, že virus přetrvává ve více typech buněk a tkáňových místech, a to jak v klidových, tak v proliferujících dlouhověkých latentně infikovaných buňkách. V rámci supresivní léčby by tedy přesné odhady virového rezervoáru pomohly k lepšímu zvládnutí virové perzistence, což by zase mohlo překonat stávající bariéry pro dosažení vyléčení(21).

Celková HIV DNA je referenční biomarker, který zahrnuje integrovanou i neintegrovanou HIV DNA a odráží globální úroveň virového rezervoáru. Důležité je, že Buzon a kol. uvádějí statistickou korelaci mezi dobou od infekce HIV do zahájení léčby a celkovou hladinou HIV DNA po 10 letech nepřetržité léčby v kohortě dospělých poprvé léčených časnou infekcí (22). U dětí byla hladina HIV DNA výrazně nižší, když bylo dosaženo virové kontroly před dosažením věku 1 roku (23). Ve srovnání s jinými markery má celková HIV DNA výhodu snadné kvantifikace pomocí standardizované, citlivé PCR v reálném čase, včetně digitální kapkové PCR (ddPCR) (24).

Generalizovaná imunitní aktivace je charakteristickým znakem infekce HIV-1. V tomto stavu různé imunitní buňky vykazují zvýšenou expresi aktivace, proliferace a apoptotických markerů, buněčný obrat s aberantní regulací buněčného cyklu, produkci prozánětlivých cytokinů a zvýšenou fibrózu lymfoidní tkáně (25). Imunitní aktivace je silně spojena s progresí onemocnění HIV-1; například aktivace T buněk, měřená expresí CD38 a HLA-DR, je více prediktivní pro depleci CD4+T buněk a kratší přežití než je plazmatická virová zátěž (26, 27). Kromě toho úroveň imunitní aktivace v rané fázi infekce HIV-1 měřená aktivací CD8+T buněk předpovídá ztrátu CD4+T buněk nezávisle na hladinách RNA HIV-1 v plazmě (28). Potlačení virové replikace účinnou antiretrovirovou léčbou (ART) snižuje imunitní aktivaci, ale ani účinné režimy ART nejsou schopny snížit úrovně imunitní aktivace u jedinců infikovaných HIV na úroveň pozorovanou u zdravých jedinců (25). Děti infikované HIV, i když jsou úspěšně léčeny ART, čelí celoživotně zvýšené imunitní aktivaci. Vyhodnocení potenciálního dopadu chronické imunitní aktivace a zánětu na vyvíjející se imunitní systém a na výsledek onemocnění u pediatrické infekce HIV je tedy zvláště důležité. Nedávné studie ukázaly, že markery imunitní aktivace (HLA-DR, CD38) a vyčerpání (Tim-3, PD-1, Lag-3) jsou silně spojeny s velikostí rezervoáru u dospělých léčených ART, lze tedy předpokládat, že minimalizace virových rezervoár s časnou ART by mohl stejně tak minimalizovat úroveň imunitní aktivace a „stárnutí“ nemocí jiných než AIDS spojených s přetrvávající imunitní aktivací.

Existují omezené důkazy pro charakterizaci rezervoárů HIV v regionu západní a střední Afriky, což je geografické prostředí s nejvyšší variabilitou v cirkulujících kmenech HIV-1 a HIV-2 (29, 30). Například Kamerun, zoonotické epicentrum HIV-1, je hostitelem značně rozmanité krajiny HIV řízené rekombinantem CRF02_AG, včetně většiny subtypů skupiny M (sub-) podtypů, obrovského množství URF a CRF a skupiny N, viry O, P a HIV-2 (31-33). Vytváření výchozích dat o genotypovém a kvantitativním profilu virového rezervoáru v několika kladech HIV v prostředí, jako je Kamerun, by tedy poskytlo informace o návrhu optimálních strategií pro léčbu HIV. Vzhledem k výše uvedené zranitelnosti adolescentů s vertikální infekcí a omezeným znalostem o virových rezervoárech a imunitní aktivaci/zánětlivé reakci v této populaci budou důkazy získané z tohoto cíle vysoce komplementární se současným globálním úsilím. Takové důkazy, vytvořené v souvislosti s vysokou zátěží koinfekcí (34, 35), by mohly zobrazovat odlišné mechanismy perzistence HIV, které jsou daleko od mechanismů hlášených v jiných částech světa.

Přípravné práce:

V rámci probíhající studie EDCTP READY-Study jsme vytvořili kohortu 292 vertikálně infikovaných adolescentů (10-19 let), kteří dostávají ART v Kamerunu. V této kohortě jsme zaznamenali míru 40% nedetekovatelné virové zátěže (<40 kopií/ml) po mediánu 8 let ART, přibližně 20% míru imunologického selhání (CD4<250 buněk/mm3) a méně než 10% klinické selhání (tj. WHO stadia III/IV) (36). Tato populace nabízí jedinečnou příležitost porozumět velikosti a povaze rezervoáru, variabilitě imunitní odpovědi/profilování cytokinů a účinku virového podtypu, historii léčby (režim ART a trvání), rozdílům mezi pohlavími a úrovni adherence na kontrolu virový rezervoár.

CÍL:

Cílem této studie je charakterizovat HIV rezervoáry a jejich variabilitu podle virologických a imunologických profilů vertikálně infikovaných adolescentů, kteří dostávají antiretrovirovou terapii v Kamerunu, a zlepšit tak porozumění virovým rezervoárům a poskytnout přesná a spolehlivá data pro výzkum léčby HIV.

Specifické cíle:

V této studii budeme: 1- Stanovit HIV-1 genetickou variabilitu a lékovou rezistenci v buněčných rezervoárech; 2- Charakterizujte imunitní aktivaci/zánět u adolescentů vertikálně infikovaných HIV-1; 3- Vyhodnoťte velikost zásobníku HIV; 4- Zhodnoťte účinek antiretrovirové terapie a imunitní odpovědi na profil virového rezervoáru.

Materiály a metody Návrh studie Plánujeme provést observační a srovnávací studii mezi dospívajícími žijícími s HIV a léčenými ART v Kamerunu. Účastníci budou vybráni a zapsáni ze stávající kohorty téměř 300 vertikálně infikovaných adolescentů přijatých do studie EDCTP-READY.

Hlavním cílem studie EDCTP-READY-Study bylo zhodnotit odpověď na léčbu, lékovou rezistenci a variabilitu HIV-1 u adolescentů na antiretrovirové terapii první a druhé linie v Kamerunu (7). V této studii jsme přijali 296 HIV+ adolescentů a porovnali genotypový profil HIV-1 v cirkulující RNA. Z 30 % (89/296) APHI s virologickým selháním (VL>1000 kopií/ml).

Metoda odběru vzorků:

Vzorky krve budou odebírány účastníkům studie EDCTP-READY podle kritérií způsobilosti.

Kritéria způsobilosti:

Kritéria zařazení: Do studie budou zařazeni HIV+ adolescenti ve věku 10-19 let, vertikálně infikovaní, byli na ART po dobu nejméně 12 měsíců, kteří poskytli svůj písemný souhlas a jejichž zákonný zástupce poskytl písemný souhlas.

Kritéria nezařazení: Nebude uvažováno pro zařazení, HIV+ dospívající s neúplnou ART anamnézou, HBV/HCV a koinfekcemi malárie.

Kritéria vyloučení: Za vyloučeného ze studie bude považován každý účastník, který se svobodně rozhodne odstoupit poté, co dal souhlas nebo nemohl poskytnout vzorek krve.

Velikost vzorku: Minimální velikost vzorku (N) studie je 90 účastníků, vypočítaná na základě následujícího vzorce: N=p (1-p) (Zα2/α2); N = 0,02 (1-0,02) (1,962/0,052) = 30 na rameno (rameno-A: VL<40 kopií/ml; rameno-B: VL 40-999 kopií/ml; rameno-C: virová zátěž ≥1000 kopií/ml). P je prevalence adolescentů žijících s HIV v Kamerunu s P=2 % [3]; α jako riziko souhlasí s α = 5 %; Zα je malá mezera se Zα = 1,96.

Poznámka: Skupina 30 HIV-negativních dospívajících bude sloužit jako kontrola pro imunologické profilování.

Všem účastníkům bude přiděleno nové identifikační číslo a data budou centralizována v heslem chráněném počítači v Mezinárodním referenčním centru Chantal Biya (CIRCB) pro výzkum prevence a léčby HIV/AIDS.

Studijní postupy a proměnné Postupy a časové harmonogramy Tato studie vyžaduje dokončení 18 měsíců: 3 měsíce (měsíc 1-3) pro administraci a etické schválení, 12 měsíců (měsíc 4 až 15) pro zápis účastníků, odběr vzorků a laboratorní analýzy, 3 měsíce (měsíc 16 až 18) pro zpracování dat a vykazování, další podrobnosti viz Ganttův diagram.

Na základě zařazovacích kritérií budou ze studie EDCTP-READY vybrány formuláře kazuistik HIV+ adolescentů a bude kontaktován jejich zákonný zástupce. Souhlas a souhlas informovaný zmocněncem bude získán od mladistvých a zákonných zástupců. Sociodemografická, klinická data a anamnéza ART budou znovu posuzovány za období během zařazení do studie EDCTP-READY. Poté bude zařazeno 90 nebo více HIV+ adolescentů [30 na rameno (rameno-A: VL<40 kopií/ml; rameno-B: VL 40-999 kopií/ml; rameno-C: virová zátěž ≥1000 kopií/ml)] . Bude zařazena skupina 30 HIV negativních adolescentů, kteří budou sloužit jako kontrola pro imunologické profilování. Intravenózní krev (5 ml x 2) bude odebrána vyškoleným flebotomem pro laboratorní analýzy včetně izolace PBMC, izolace plazmy a buffy coat, počty CD4/CD8, plazmatická virová nálož (PVL), hodnocení imunitní aktivace / zánětlivých markerů, HIV-RNA a HIV-DNA genotypizace, kvantifikace virových rezervoárů.

HIV negativní účastníci budou náborováni v CIRCB, tato instituce je od roku 2006 referenčním centrem pro management HIV infikovaných jedinců a jako taková je renomovaným referenčním centrem pro testování HIV. Na základě této výhody organizuje CIRCB ročně bezplatné screeningové testy na HIV/HBV/HCV pro několik institucí a komunit, proto bude podobná bezplatná testovací kampaň organizována v nedaleké střední škole a tato studie bude prezentována těm, kteří splňují kritéria pro zařazení. . Případní účastníci budou pozváni na CIRCB se svým zákonným zástupcem k zápisu.

Vzorky budou odebrány pouze jednou při zápisu, stejně jako všechny relevantní sociodemografické a klinické údaje. Vzorky budou transportovány do CIRCB ve stejný den pro izolaci PBMC, izolaci DNA, plazmy a buffy coat, počty CD4/CD8 a hodnocení aktivačních/zánětlivých markerů pomocí průtokové cytometrie. Plazma bude odebírána a skladována při -80oC pro plazmatickou virovou zátěž (PVL), genotypizaci, imunitní aktivaci / hodnocení zánětlivých markerů pomocí testů ELISA (nebo průtokové cytometrie). HIV-DNA bude následně extrahována z PBMC a skladována při -80oC; HIV-DNA bude zasílána každé tři měsíce na oddělení experimentální medicíny, University of Rome Tor Vergata, Řím, Itálie, pro kvantifikaci virového rezervoáru HIV (viz dopis o spolupráci v části přílohy).

Laboratorní postupy Počet CD4/CD8: Měření CD4/CD8 se určí pomocí přístroje průtokové cytometrie, jak bylo popsáno dříve (37).

Plazmatická virová zátěž: Plazmatická virová zátěž bude stanovena pomocí m 2000rt Abbott systému v reálném čase, jak bylo popsáno dříve (38).

Extrakce HIV-RNA: ARN bude extrahován ze vzorků plazmy pomocí sady Qiamp viral RNA Mini Kit (Qiagen), jak je popsáno výrobcem.

Provirová extrakce DNA z buffy coat: Provirová DNA bude extrahována pomocí soupravy pro extrakci krve a tkáně DNeasy (Qiagen), jak je popsáno výrobcem.

Izolace PBMC: PBMC budou izolovány centrifugací v hustotním gradientu s použitím Ficoll za použití interního protokolu.

Extrakce HIV-DNA z PBMC: HIV-DNA bude extrahována pomocí QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen), jak je popsáno výrobcem.

Amplifikace a sekvenování genů HIV-1: Sangerovo sekvenování pro testování lékové rezistence na HIV-1 bude provedeno u dospívajících, u kterých došlo k virologickému selhání, podle interního protokolu, jak bylo dříve popsáno naší výzkumnou skupinou (39). Sekvence DNA reverzní transkriptázy budou analyzovány na mutace lékové rezistence pomocí algoritmu interpretace genotypové rezistence databáze Stanfordské univerzity (www.stanford.edu).

Fylogenetická analýza: Fylogenetické stromy Neighbour Joining budou vytvořeny pomocí softwaru MEGA (Kimura 2-parameter model, 200 bootstrap replikations) a FigTree (40, 41).

Imunitní profilování: Oba imunitní aktivační/zánětlivé cytokiny (IL-1, IL2, IL4, IL6, IL10, IL12 a TNF-alfa) budou hodnoceny pomocí komerčních souprav ELISA a průtokové cytometrie.

Kvantifikace HIV virových rezervoárů: virové rezervoáry budou kvantifikovány pomocí kapkové digitální PCR (ddPCR), jak bylo popsáno dříve. Je třeba poznamenat, že tato kvantifikace bude provedena na katedře experimentální medicíny, University of Rome Tor Vergata, Řím, Itálie, jak je uvedeno v dopise o spolupráci v příloze tohoto návrhu. Před odesláním vzorku do UTV bude mezi CIRCB a UTV podepsán převod materiálu a dohoda o sdílení dat. Jedná se o interní protokol pro HIV-1 B subtyp a bude upraven pro HIV-1 non-B subtypy očekávané z kamerunských vzorků.

Analýza dat Data shromážděná během studie budou analyzována pomocí softwaru SPSS. Související faktory budou hodnoceny pomocí vícerozměrné logistické regrese s přístupem odhadu pro nezaujatý účinek různých parametrů. Údaje budou hlášeny jako medián. Pro data, která nejsou normálně distribuována, budou použity neparametrické testy, porovnání mediánů mezi různými skupinami (virologická úspěšnost vs virologické selhání) bude provedeno U-Mann-Whitneyovým testem. Korelace budou provedeny Spearmanovým testem a hodnoty p menší než 0,05 budou považovány za statisticky významné.

Etická hlediska Tato studie bude provedena v souladu s Helsinskou deklarací o etických zásadách lékařského výzkumu zahrnujícího lidské subjekty. Etické povolení bude získáno od Kamerunské národní etické komise pro výzkum lidského zdraví. po informovaném oznámení o studii bude bez jakéhokoli nátlaku získán písemný zástupce informovaný od zákonného zástupce a písemný souhlas také od zúčastněného HIV+ dospívajícího. Soukromí a důvěrnost budou zajištěny pomocí jedinečných identifikátorů a databáze chráněné heslem a budou k nim mít přístup pouze oprávnění pracovníci. Účastníci budou mít možnost kdykoli záměrně opustit studii, aniž by to mělo vliv na jejich rutinní sledování na studijní klinice. Flebotomie bude neinvazivní (venepunkce) a bude ji provádět vyškolená zdravotní sestra.

Zajištění kvality:

Součástí našeho studijního týmu bude pracovník pro zajišťování kvality, který bude odpovědný za všechny standardní operační postupy pro protokol studie a bude řídit testování odbornosti a validaci dat během celé studie.

Řízení potenciálních rizik: Rizika pro pacienty jsou minimální, protože jedinou procedurou, které je dobrovolník podroben, je venepunkce flebotomem nebo lékařem. Venepunkce může být mírně bolestivá, ale prakticky bez rizika komplikací. Potenciální rizika pro subjekty, z nichž žádné pravděpodobně nenastanou, mohou zahrnovat okamžitou bolest, modřinu v místě nebo možnou (ale extrémně nepravděpodobnou) infekci. Pokud takové komplikace nastanou, bude účastníkovi poskytnuto neodkladné lékařské ošetření.