Charakterystyka zbiorników wirusa HIV-1 u młodzieży niezakażonej wirusem HIV-1 niezakażonej grupy B w badaniu ART w Kamerunie (AVIR)

Tytuł: Charakterystyka rezerwuarów wirusowych wśród młodzieży zakażonej pionowo wirusem HIV-1 innej niż B, otrzymującej terapię antyretrowirusową w Kamerunie.

Akronim: badanie AVIR, rezerwuar wirusa dla młodzieży

Znaczenie i znaczenie Afryka Subsaharyjska (SSA) jest nieproporcjonalnie dotknięta wirusem HIV/AIDS, co powoduje blisko 70% światowych epidemii. Przy największym obciążeniu zakażeniami wirusem HIV u dzieci, około 9 na 10 dzieci zakażonych wirusem HIV występuje w regionie Afryki Południowej (1, 2). Nastolatkowie i młodzi ludzie stanowią coraz większą część osób żyjących z HIV na całym świecie. W 2019 r. około 1,7 mln [1,1 mln-2,4 milionów] nastolatków w wieku od 10 do 19 lat na całym świecie było zakażonych wirusem HIV, co stanowi około 5% wszystkich osób żyjących z wirusem HIV, około 1,5 miliona [1,0–2,1 miliona], czyli 88% nastolatków zakażonych wirusem HIV żyje w Afryce Południowej. Tylko w 2019 r. 460 000 [260 000–680 000] młodych ludzi w wieku od 10 do 24 lat zostało niedawno zakażonych wirusem HIV, z czego 170 000 [53 000–340 000] to nastolatki w wieku od 10 do 19 lat. Co więcej, najnowsze dane wskazują, że jedynie 27% dorastających dziewcząt i 16% dorastających chłopców w wieku 15–19 lat w Afryce Wschodniej i Południowej – regionie najbardziej dotkniętym wirusem HIV – zostało przebadanych na obecność wirusa HIV w ciągu ostatnich 12 miesięcy i otrzymało wynik ostatniego testu. Liczba testów w Afryce Zachodniej i Środkowej oraz Azji Południowej jest jeszcze niższa. Jeśli obecne tendencje się utrzymają, w nadchodzących latach setki tysięcy kolejnych osób zostanie nosicielami wirusa HIV, a nastolatkowie, nie znając swojego statusu, nie będą mogli skorzystać z leczenia ratującego życie. Ponadto duża populacja dzieci zakażonych wirusem HIV w okresie okołoporodowym w ciągu ostatniej dekady wkracza w okres dojrzewania (3). Spośród szacunkowych 690 000 osób, które zmarły w 2019 r. na choroby związane z AIDS, 110 000 (czyli około 16%) to dzieci w wieku poniżej 20 lat. (Światowe i regionalne trendy UNICEF, lipiec 2020 r.).

Wraz z pojawieniem się i skalowalnością terapii antyretrowirusowej (ART) nastąpił globalny spadek liczby zgonów związanych z AIDS. Na koniec 2019 r. z terapii przeciwretrowirusowej korzystało 25,4 mln osób, co stanowi 67% wszystkich osób żyjących z wirusem HIV. Jednak tylko 53% dzieci zakażonych wirusem HIV otrzymywało ART. Co ciekawe, około 94% wszystkich dzieci otrzymujących ART pochodzi z Afryki Południowej (4). W kontekście ciągłych nowych zakażeń wirusem HIV u dzieci i rosnącego zasięgu pediatrycznej ART, liczba dzieci zakażonych wirusem HIV wzrośnie, co sugeruje większe prawdopodobieństwo osiągnięcia wieku młodzieńczego, a nawet dorosłości, jeśli schematy leczenia pozostaną w pełni skuteczne w kontrolowaniu zakażenia wirusem HIV (3, 4). ADLHIV stanowi zatem populację HIV o rosnących problemach zdrowotnych i z bardzo ograniczonymi wynikami dotyczącymi możliwych do uogólnienia najlepszych praktyk specyficznych dla tej populacji docelowej, zwłaszcza w Afryce Południowej.

Podobnie jak kilka krajów Afryki Zachodniej i Środkowej, Kamerun w dalszym ciągu boryka się z uogólnioną epidemiologią HIV (2,7% częstości występowania) (5), z większą częstością występowania wśród kobiet w ciąży (5,7%) i niemowląt/dzieci narażonych na zakażenie wirusem HIV (5,8% [958/16 638 ] dodatni wynik w pierwszej reakcji PCR i 15% na końcu kaskady PMTCT) (6). Według stanu na czerwiec 2018 r. ogólnokrajowy zasięg ART wynosił 51,5% (281 083), co obejmuje 12 362 dzieci poniżej 15 roku życia (6). Jeśli chodzi o odpowiedź na ART w Kamerunie, odnotowaliśmy ogólny wskaźnik supresji wirusa wynoszący 79,4%, przy znacznych różnicach w różnych przedziałach wiekowych: 81,1% u dorosłych, 75,6% u dzieci i tylko 53,3% u młodzieży w wieku 10–19 lat (7). Podobnie jak w raportach UNAIDS, młodzież zakażona wirusem HIV (ADLHIV) stanowi populację najbardziej bezbronną i najbardziej zaniedbaną w odpowiedzi na epidemie(1, 5). Aby zapewnić bezpieczniejszy rozwój w kierunku dorosłości, należy nadać tej populacji priorytet w poszukiwaniu innowacyjnych strategii leczenia, które zapewnią jej dobrostan i przyczynią się do rozwoju SSA.

Pomimo niekwestionowanych korzyści ART, obecne strategie leczenia mają pewne ograniczenia. Warto zauważyć, że obecny charakter ART przez całe życie wiąże się z wyzwaniami związanymi z przestrzeganiem zaleceń przez większość pacjentów, toksyczność przypisana ART i utrzymujące się zaburzenia układu odpornościowego powodują znaczne upośledzenie zdrowia, a oporność na leki HIV (HIVDR) rośnie, głównie w krajach Afryki Subsaharyjskiej, gdzie większość doświadczonych w ART pacjentów żyje (8). Istnieje ryzyko pojawienia się nowej epidemii HIV, spowodowanej przez HIVDR istniejącym lekiem przeciwretrowirusowym. Wyzwania te są szczególnie istotne w przypadku populacji pediatrycznej ze względu na ograniczone możliwości stosowania ART, złą formułę leków i coraz częstsze przypadki nieprzestrzegania zaleceń w miarę zbliżania się okresu dojrzewania. Wyzwania te wymagają podejścia do (funkcjonalnego) wyleczenia lub remisji wirusa HIV, szczególnie w przypadku najbardziej bezbronnych populacji (tj. ADLHIV) (7, 9).

Koncepcje leżące u podstaw projektu, w tym pomysły i modele lub założenia, strategie remisji lub eradykacji wirusa HIV-1 mają na celu osiągnięcie remisji wirusa w przypadku braku terapii przeciwretrowirusowej (ART). Opracowanie leku na HIV-1 pozostaje wyzwaniem ze względu na ukryte rezerwuary wirusa. Zbiornik latentny wirusa HIV-1 (LR) można zdefiniować jako frakcję komórek zawierających ciche transkrypcyjnie prowirusowe DNA, które po aktywacji są zdolne do wytwarzania zakaźnych wirionów(10). Komórki T CD4 z pamięcią spoczynkową są głównym gospodarzem LR, ale infekcja HIV-1 w tych komórkach jest nieskuteczna ze względu na ich niską ekspresję koreceptora i nieodłączne ograniczenia odwrotnej transkrypcji (11, 12). Niemniej jednak istnieją dowody na to, że wirus HIV-1 może infekować spoczynkowe komórki T CD4 bezpośrednio lub poprzez transmisję z komórki na komórkę, chociaż infekcja tych komórek wiąże się z wolniejszą kinetyką replikacji (13). Alternatywnie, latencję ustala się, gdy podzbiór zainfekowanych, aktywowanych komórek T CD4 powraca do fenotypu pamięci spoczynkowej, skutecznie wyciszając ekspresję genów wirusa, jednocześnie podtrzymując prowirusowe DNA w perspektywie długoterminowej(14). Prowirus jest utrzymywany w tych komórkach w stanie spoczynku za pośrednictwem czynników gospodarza, takich jak supresja epigenetyczna, wyczerpanie czynników transkrypcyjnych, takich jak NF-κB i interferencja transkrypcji w wyniku integracji z eksprymowanymi genami, co omówiono bardziej szczegółowo (15). Odbicie wirusa od LR po zaprzestaniu leczenia ART jest szybkie i prowadzi do wykrywalnej wiremii w ciągu kilku tygodni od przerwania terapii (16). Ponadto rozpoczęcie ART na wczesnym etapie infekcji nie jest wystarczające, aby zatrzymać tworzenie się LR, co sugeruje, że LR ustala się i rozprzestrzenia wcześnie (Chun i in., 1998; Whitney i in., 2014; Colby i in., 2018), nawet u dzieci zakażonych wertykalnie, które rozpoczęły terapię ART wkrótce po urodzeniu (17). Utajony rezerwuar jest stabilny pomimo lat supresyjnej ART i jest źródłem wiremii z odbicia po przerwaniu terapii. Komórki zakażone latentnie stanowią zatem główną barierę w wyleczeniu wirusa HIV-1 i powinny być przedmiotem specjalnych nowatorskich strategii leczenia i eliminacji.

Postęp w opracowaniu funkcjonalnego lub sterylizującego leku na HIV-1 został znacząco utrudniony przez obecność LR. Obecnie dwie osoby zostały wyleczone z zakażenia wirusem HIV-1, tak zwani pacjenci z Berlina i Londynu, którzy od czasu otrzymania allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych od dawców CCR5?32/?32, stale uzyskują negatywne wyniki testów na obecność wirusa nawrotu od ponad 10 i 2 lat. lat bez ART (18). W tych przypadkach pula zakażonych komórek została znacząco uszczuplona podczas kondycjonowania przed przeszczepieniem i zastąpiona komórkami dawcy, które są odporne na zakażenie wirusem R5-tropowym z powodu dużej delecji w koreceptorze CCR5 (19). Ze względu na względną niedostateczną liczbę dawców CCR5 ?32/?32 i wyjątkowe okoliczności determinujące te przypadki, ten rodzaj leczenia nie jest możliwy do powszechnego stosowania, jednakże podkreśla podstawową zasadę wyleczenia HIV-1; wyciszenie lub wyeliminowanie wirusa HIV-1 LR (20). W ciągu ostatniej dekady zrozumienie tego, gdzie i w jaki sposób wirus HIV utrzymuje się u osób stosujących ART, znacznie się zmieniło, dostarczając dowodów na to, że wirus utrzymuje się w wielu typach komórek i miejscach w tkankach, zarówno w komórkach nieaktywnych, jak i proliferujących, długowiecznych, utajonych zakażonych. Zatem w ramach leczenia supresyjnego dokładne oszacowanie rezerwuaru wirusa pomogłoby w lepszym opanowaniu trwałości wirusa, co z kolei mogłoby pokonać istniejące bariery w osiągnięciu wyleczenia(21).

Całkowite DNA HIV jest biomarkerem referencyjnym, który obejmuje zarówno zintegrowane, jak i niezintegrowane DNA HIV i odzwierciedla globalny poziom rezerwuaru wirusa. Co ważne, Buzon i in. podali statystyczną korelację między czasem od zakażenia wirusem HIV do rozpoczęcia leczenia a całkowitym poziomem DNA wirusa HIV po 10 latach ciągłego leczenia w kohorcie dorosłych leczonych po raz pierwszy wczesną infekcją (22). U dzieci poziom DNA wirusa HIV był znacząco niższy, gdy kontrolę wirusa uzyskano przed 1. rokiem życia (23). W porównaniu z innymi markerami, zaletą całkowitego DNA HIV jest łatwe oznaczenie ilościowe za pomocą standaryzowanej, czułej reakcji PCR w czasie rzeczywistym, w tym cyfrowej reakcji PCR metodą kropelkową (ddPCR) (24).

Uogólniona aktywacja układu odpornościowego jest cechą charakterystyczną zakażenia wirusem HIV-1. W tym stanie różne komórki układu odpornościowego wykazują zwiększoną ekspresję markerów aktywacji, proliferacji i apoptozy, obrót komórkowy z nieprawidłową regulacją cyklu komórkowego, wytwarzanie cytokin prozapalnych i zwiększone zwłóknienie tkanki limfatycznej (25). Aktywacja immunologiczna jest silnie powiązana z postępem choroby HIV-1; na przykład aktywacja limfocytów T, mierzona ekspresją CD38 i HLA-DR, pozwala lepiej przewidzieć ubytek limfocytów T CD4+ i krótsze przeżycie niż miano wirusa w osoczu (26, 27). Co więcej, poziom aktywacji układu odpornościowego na początku zakażenia HIV-1, mierzony aktywacją limfocytów T CD8+, pozwala przewidzieć utratę limfocytów T CD4+ niezależnie od poziomu RNA HIV-1 w osoczu (28). Tłumienie replikacji wirusa za pomocą skutecznego leczenia przeciwretrowirusowego (ART) zmniejsza aktywację układu odpornościowego, ale nawet skuteczne schematy leczenia ART nie są w stanie zmniejszyć poziomu aktywacji układu odpornościowego u osób zakażonych wirusem HIV do poziomu obserwowanego u osób zdrowych (25). Dzieci zakażone wirusem HIV, nawet jeśli zostaną skutecznie wyleczone metodą ART, przez całe życie będą musiały mierzyć się z podwyższoną aktywacją układu odpornościowego. Dlatego też szczególnie ważna jest ocena potencjalnego wpływu przewlekłej aktywacji układu odpornościowego i stanu zapalnego na rozwijający się układ odpornościowy i przebieg choroby w przypadku zakażenia wirusem HIV u dzieci. Niedawne badania wykazały, że aktywacja immunologiczna (HLA-DR, CD38) i markery wyczerpania (Tim-3, PD-1, Lag-3) są silnie powiązane z wielkością zbiornika u dorosłych leczonych ART, dlatego można przewidywać, że minimalizowanie wirusa rezerwuar wczesnej ART może w równym stopniu zminimalizować poziom aktywacji układu odpornościowego i choroby niezwiązane z AIDS związane z „starzeniem się” układu odpornościowego, związane z trwałą aktywacją układu odpornościowego.

Istnieją ograniczone dowody na scharakteryzowanie rezerwuarów wirusa HIV w regionie Afryki Zachodniej i Środkowej, czyli w regionie geograficznym charakteryzującym się największą zmiennością pod względem krążących szczepów HIV-1 i HIV-2 (29, 30). Na przykład Kamerun, epicentrum odzwierzęcego wirusa HIV-1, jest gospodarzem niezwykle zróżnicowanego krajobrazu wirusa HIV napędzanego przez rekombinantę CRF02_AG, w tym większość podtypów grupy M, szeroki wachlarz URF i CRF oraz grupa N, Wirusy O, P i HIV-2(31-33). Zatem wygenerowanie podstawowych danych na temat profilu genotypowego i ilościowego rezerwuaru wirusa w kilku kladach HIV w warunkach takich jak Kamerun mogłoby pomóc w opracowaniu optymalnych strategii leczenia HIV. Biorąc pod uwagę wspomnianą powyżej podatność nastolatków na infekcję wertykalną oraz ograniczoną wiedzę na temat rezerwuarów wirusów i aktywacji układu odpornościowego/reakcji zapalnej w tej populacji, dowody uzyskane na podstawie tego celu będą w dużym stopniu uzupełniać obecne wysiłki globalne. Takie dowody, uzyskane w kontekście dużego obciążenia koinfekcjami (34, 35), mogą ukazać odmienne mechanizmy utrzymywania się wirusa HIV, odmienne od tych zgłaszanych w innych częściach świata.

Prace wstępne:

W ramach trwającego badania EDCTP READY utworzyliśmy kohortę 292 nastolatków (10–19 lat) zakażonych wertykalnie, otrzymujących ART w Kamerunie. W tej kohorcie zaobserwowaliśmy odsetek niewykrywalnego poziomu wirusa wynoszący 40% (<40 kopii/ml) po medianie trwającej 8 lat terapii ART, około 20% wskaźnik niepowodzenia immunologicznego (CD4 <250 komórek/mm3) i mniej niż 10% przypadków klinicznych porażka (tj. Etapy III/IV WHO) (36). Populacja ta oferuje wyjątkową okazję do zrozumienia wielkości i charakteru zbiornika, zmienności odpowiedzi immunologicznej/profilu cytokin oraz wpływu podtypu wirusa, historii leczenia (schemat ART i czas trwania), różnic między płciami i poziomu przestrzegania zaleceń na kontrolę rezerwuar wirusa.

CEL:

Celem tego badania jest scharakteryzowanie rezerwuarów wirusa HIV i ich zmienności zgodnie z profilami wirusologicznymi i immunologicznymi nastolatków zakażonych wertykalnie otrzymujących terapię przeciwretrowirusową w Kamerunie, a tym samym lepsze zrozumienie rezerwuarów wirusa i dostarczenie dokładnych i wiarygodnych danych do badań nad wyleczeniem wirusa HIV.

Konkretne cele:

W tym badaniu będziemy: 1- Określać zmienność genetyczną wirusa HIV-1 i lekooporność w rezerwuarach komórkowych; 2- Scharakteryzuj aktywację/zapalenie układu odpornościowego u nastolatków zakażonych pionowo wirusem HIV-1; 3- Oceń wielkość rezerwuaru wirusa HIV; 4- Ocenić wpływ terapii przeciwretrowirusowej i odpowiedzi immunologicznej na profil rezerwuaru wirusa.

Materiały i metody Projekt badania Planujemy przeprowadzić badanie obserwacyjne i porównawcze wśród nastolatków żyjących z HIV i otrzymujących ART w Kamerunie. Uczestnicy zostaną wybrani i zapisani z istniejącej kohorty blisko 300 nastolatków zakażonych wertykalnie, rekrutowanych do badania EDCTP-READY.

Głównym celem badania EDCTP-READY była ocena odpowiedzi na leczenie, oporności na leki i zmienności wirusa HIV-1 wśród nastolatków otrzymujących terapię przeciwretrowirusową pierwszego i drugiego rzutu w Kamerunie (7). Do tego badania zrekrutowaliśmy 296 nastolatków zakażonych wirusem HIV i porównaliśmy profil genotypowy HIV-1 w krążącym RNA. Spośród 30% (89/296) APHI doświadcza niepowodzenia wirusologicznego (VL>1000 kopii/ml).

Metoda próbkowania:

Od uczestników badania EDCTP-READY zostaną pobrane próbki krwi zgodnie z kryteriami kwalifikacyjnymi.

Kryteria kwalifikacji:

Kryteria włączenia: Do badania zostanie włączona młodzież HIV+ w wieku 10–19 lat, zakażona wertykalnie, przyjmująca ART od co najmniej 12 miesięcy, która przedstawi pisemną zgodę i której opiekun prawny przedstawi pisemną zgodę pełnomocnika.

Kryteria niewłączenia: nie będą brane pod uwagę przy włączeniu do badania, młodzież zakażona wirusem HIV z niepełną historią ART, współinfekcja HBV/HCV i malarią.

Kryteria wykluczenia: Za wykluczonego z badania zostanie uznany każdy uczestnik, który dobrowolnie zdecyduje się wycofać po wyrażeniu zgody lub braku możliwości oddania próbki krwi.

Wielkość próby: Minimalna liczebność próby (N) w badaniu wynosi 90 uczestników, obliczona na podstawie następującego wzoru: N=p (1-p) (Zα2/α2); N = 0,02(1-0,02) (1,962/0,052) = 30 na ramię (ramię A: VL<40 kopii/ml; ramię B: VL 40–999 kopii/ml; ramię C: wiremia ≥1000 kopii/ml). P to częstość występowania młodzieży zakażonej wirusem HIV w Kamerunie, gdzie P = 2% [3]; α będące ryzykiem zgadza się z α = 5%; Zα jest małą luką, gdzie Zα = 1,96.

Uwaga: Grupa 30 nastolatków zakażonych wirusem HIV będzie służyć jako kontrola w profilowaniu immunologicznym.

Wszystkim uczestnikom zostanie przypisany nowy numer identyfikacyjny, a dane zostaną scentralizowane w komputerze chronionym hasłem w Międzynarodowym Centrum Referencyjnym Chantal Biya (CIRCB) w celu prowadzenia badań nad zapobieganiem i zarządzaniem HIV/AIDS.

Procedury i zmienne badawcze Procedury i harmonogramy Ukończenie niniejszego badania wymaga 18 miesięcy: 3 miesiące (miesiące 1–3) na administrację i zatwierdzenie etyki, 12 miesięcy (miesiące 4–15) na włączenie uczestników, pobieranie próbek i analizy laboratoryjne, 3 miesiące (miesiące 16–18) na przetwarzanie danych i raportowanie, więcej szczegółów można znaleźć na wykresie Gantta.

Na podstawie kryteriów włączenia z badania EDCTP-READY zostaną wybrane formularze zgłoszeń przypadków młodzieży zakażonej wirusem HIV i skontaktuje się z jej opiekunem prawnym. Zgoda i zgoda wyrażona przez pełnomocnika zostaną uzyskane odpowiednio od nastolatka i opiekuna prawnego. Dane społeczno-demograficzne, kliniczne i historia ART zostaną ponownie ocenione w okresie włączenia do badania EDCTP-READY. Następnie do badania zostanie włączonych 90 lub więcej nastolatków zakażonych wirusem HIV [30 na ramię (ramię A: VL < 40 kopii/ml; ramię B: VL 40–999 kopii/ml; ramię C: wiremia ≥1000 kopii/ml)] . Do badania zostanie włączona grupa 30 nastolatków zakażonych wirusem HIV, która będzie stanowić kontrolę w profilowaniu immunologicznym. Krew dożylna (5 ml x 2) zostanie pobrana przez przeszkolonego flebotomistę do analiz laboratoryjnych, obejmujących izolację PBMC, izolację osocza i kożuszka leukocytarnego, liczbę CD4/CD8, miano wirusa w osoczu (PVL), aktywację immunologiczną/ocenę markerów stanu zapalnego, HIV-RNA i Genotypowanie HIV-DNA, ilościowe oznaczanie rezerwuarów wirusa.

Uczestnicy badania HIV-negatywni będą rekrutowani w CIRCB, instytucja ta jest ośrodkiem referencyjnym w zakresie postępowania z osobami zakażonymi wirusem HIV od 2006 roku i jako taka jest renomowanym ośrodkiem referencyjnym w zakresie testów na obecność wirusa HIV. Wykorzystując tę ​​zaletę, CIRCB organizuje rocznie bezpłatne badania przesiewowe w kierunku HIV/HBV/HCV dla kilku instytucji i społeczności, dlatego też w pobliskiej szkole średniej zostanie zorganizowana podobna kampania bezpłatnych testów, a niniejsze badanie zostanie zaprezentowane osobom spełniającym kryteria włączenia . Potencjalni uczestnicy zostaną zaproszeni do CIRCB wraz z opiekunem prawnym w celu rejestracji.

Próbki zostaną pobrane tylko raz w momencie rejestracji, podobnie jak wszystkie istotne dane społeczno-demograficzne i kliniczne. Próbki zostaną przetransportowane do CIRCB tego samego dnia w celu izolacji PBMC, izolacji DNA, osocza i kożuszka leukocytarnego, zliczenia CD4/CD8 oraz oceny markerów aktywacji/zapalenia za pomocą cytometrii przepływowej. Osocze będzie pobierane i przechowywane w temperaturze -80oC w celu przeprowadzenia badania wiremii w osoczu (PVL), genotypowania, aktywacji immunologicznej/oceny markerów stanu zapalnego za pomocą testów ELISA (lub cytometrii przepływowej). HIV-DNA zostanie następnie wyekstrahowane z PBMC i przechowywane w temperaturze -80oC; HIV-DNA będzie wysyłane co trzy miesiące do Wydziału Medycyny Eksperymentalnej Uniwersytetu Rzymskiego Tor Vergata w Rzymie, Włochy, w celu ilościowej oceny rezerwuaru wirusa HIV (patrz list o współpracy w części załącznika).

Procedury laboratoryjne Liczba CD4/CD8: Pomiary CD4/CD8 zostaną określone przy użyciu cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej (37).

Miano wirusa w osoczu: Miano wirusa w osoczu zostanie określone przy użyciu systemu czasu rzeczywistego m 2000rt firmy Abbott, jak opisano wcześniej (38).

Ekstrakcja HIV-RNA: ARN będzie ekstrahowany z próbek osocza przy użyciu zestawu Qiamp viral RNA Mini Kit (Qiagen) zgodnie z opisem producenta.

Ekstrakcja prowirusowego DNA z kożuszka leukocytarnego: Prowirusowy DNA zostanie ekstrahowany przy użyciu zestawu do ekstrakcji krwi i tkanek DNeasy (Qiagen) zgodnie z opisem producenta.

Izolacja PBMC: PBMC będą izolowane poprzez wirowanie w gradiencie gęstości przy użyciu Ficoll, stosując wewnętrzny protokół.

Ekstrakcja HIV-DNA z PBMC: HIV-DNA zostanie wyizolowany przy użyciu zestawu QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen) zgodnie z opisem producenta.

Amplifikacja i sekwencjonowanie genów HIV-1: Sekwencjonowanie Sangera w celu badania oporności na leki HIV-1 zostanie przeprowadzone u nastolatków, u których wystąpiło niepowodzenie wirusologiczne, zgodnie z wewnętrznym protokołem, zgodnie z wcześniejszym opisem naszej grupy badawczej(39). Sekwencje DNA odwrotnej transkryptazy będą analizowane pod kątem mutacji lekooporności przy użyciu algorytmu interpretacji genotypowej oporności z bazy danych Uniwersytetu Stanforda (www.stanford.edu).

Analiza filogenetyczna: Drzewa filogenetyczne Neighbor Joining zostaną utworzone przy użyciu oprogramowania MEGA (2-parametrowy model Kimura, 200 replikacji bootstrap) i FigTree (40, 41).

Profilowanie immunologiczne: Zarówno aktywacja immunologiczna/cytokiny zapalne (IL-1, IL2, IL4, IL6, IL10, IL12 i TNF-alfa) będą oceniane przy użyciu dostępnych na rynku zestawów ELISA i cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja rezerwuarów wirusa HIV: rezerwuary wirusa zostaną określone ilościowo za pomocą cyfrowej PCR kropelkowej (ddPCR), jak opisano wcześniej. Należy zauważyć, że oznaczenie ilościowe zostanie przeprowadzone na wydziale medycyny eksperymentalnej Uniwersytetu Rzymskiego Tor Vergata w Rzymie, Włochy, zgodnie z listem o współpracy znajdującym się w załączniku do niniejszego wniosku. Umowa o transferze materiałów i udostępnianiu danych zostanie podpisana pomiędzy CIRCB i UTV przed wysyłką próbki do UTV. Jest to wewnętrzny protokół dla podtypu HIV-1 B, który zostanie dostosowany do podtypów HIV-1 innych niż B, których można spodziewać się w próbkach z Kamerunu.

Analiza danych Dane zebrane w trakcie badania zostaną przeanalizowane przy użyciu oprogramowania SPSS. Powiązane czynniki zostaną ocenione przy użyciu wieloczynnikowej regresji logistycznej, z podejściem szacunkowym dla bezstronnego wpływu różnych parametrów. Dane będą podawane jako mediana. W przypadku danych o rozkładzie normalnym zastosowane zostaną testy nieparametryczne. Porównanie median pomiędzy różnymi grupami (sukces wirusologiczny vs niepowodzenie wirusologiczne) zostanie przeprowadzone za pomocą testu U-Manna-Whitneya. Korelacje zostaną wykonane za pomocą testu Spearmana, a wartości p mniejsze niż 0,05 zostaną uznane za statystycznie istotne.

Względy etyczne Niniejsze badanie zostanie przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską w sprawie zasad etycznych badań medycznych z udziałem ludzi. Pozwolenie etyczne zostanie uzyskane od Kamerunskiej Narodowej Komisji Etyki ds. badań nad zdrowiem ludzkim. po świadomym powiadomieniu o badaniu zostanie uzyskane pisemne pełnomocnictwo od opiekuna prawnego, a także pisemna zgoda od uczestniczącego w badaniu nastolatka zakażonego wirusem HIV, bez żadnego przymusu. Prywatność i poufność zostaną zapewnione dzięki zastosowaniu unikalnych identyfikatorów i bazy danych chronionej hasłem, a dostęp do nich będzie miał wyłącznie upoważniony personel. Uczestnicy będą mogli świadomie opuścić badanie w dowolnym momencie, bez wpływu na ich rutynowe monitorowanie w klinice badawczej. Upuszczanie krwi będzie nieinwazyjne (nakłucie żyły) i będzie wykonywane przez przeszkoloną pielęgniarkę.

Zapewnienie jakości:

W skład naszego zespołu badawczego będzie wchodzić specjalista ds. zapewnienia jakości, który będzie odpowiedzialny za wszystkie standardowe procedury operacyjne dotyczące protokołu badania oraz będzie zarządzał testowaniem biegłości i walidacją danych podczas całego badania.

Zarządzanie potencjalnym ryzykiem: Ryzyko dla pacjentów jest minimalne, ponieważ jedyną procedurą, jakiej poddawany jest ochotnik, jest wkłucie żyły przez flebotomistę lub lekarza. Wkłucie żyły może być nieco bolesne, ale praktycznie nie wiąże się z ryzykiem powikłań. Potencjalne ryzyko dla pacjentów, które prawdopodobnie nie wystąpi, może obejmować chwilowy ból, zasinienie w miejscu podania lub możliwą (ale niezwykle mało prawdopodobną) infekcję. W przypadku wystąpienia takich powikłań uczestnikowi zostanie zapewniona pomoc medyczna w trybie doraźnym.