Charakterisierung von HIV-1-Reservoirs bei HIV-1-Nicht-B-infizierten Jugendlichen auf ART in Kamerun (AVIR)

Titel: Charakterisierung von Virusreservoirs bei vertikal infizierten HIV-1-Nicht-B-Jugendlichen, die in Kamerun eine antiretrovirale Therapie erhalten.

Akronym: AVIR-Studie, Virusreservoir für Jugendliche

Bedeutung und Relevanz Subsahara-Afrika (SSA) ist überproportional von HIV/AIDS betroffen und verursacht fast 70 % der weltweiten Epidemien. Mit der höchsten Belastung durch pädiatrische HIV-Infektionen leben etwa neun von zehn Kindern mit HIV in der SSA-Region(1, 2). Jugendliche und junge Menschen machen weltweit einen wachsenden Anteil der Menschen mit HIV aus. Im Jahr 2019 wurden etwa 1,7 Millionen [1,1 Millionen-2,4 Millionen] Jugendliche im Alter zwischen 10 und 19 Jahren lebten weltweit mit HIV, was etwa 5 % aller Menschen mit HIV ausmacht, etwa 1,5 Millionen [1,0 – 2,1 Millionen] oder 88 % der HIV-infizierten Jugendlichen leben in SSA. Allein im Jahr 2019 infizierten sich 460.000 [260.000-680.000] junge Menschen im Alter zwischen 10 und 24 Jahren neu mit HIV, davon waren 170.000 [53.000-340.000] Jugendliche im Alter zwischen 10 und 19 Jahren. Erschwerend kommt hinzu, dass jüngste Daten darauf hinweisen, dass nur 27 % der heranwachsenden Mädchen und 16 % der heranwachsenden Jungen im Alter von 15 bis 19 Jahren im östlichen und südlichen Afrika – der am stärksten von HIV betroffenen Region – in den letzten 12 Monaten auf HIV getestet und empfangen wurden das Ergebnis des letzten Tests. Die Testraten in West- und Zentralafrika sowie Südasien sind sogar noch niedriger. Wenn sich der aktuelle Trend fortsetzt, werden in den kommenden Jahren Hunderttausende weitere Menschen HIV-positiv werden, und ohne ihren Status zu kennen, werden Jugendliche keine lebensrettende Behandlung erhalten. Darüber hinaus wächst eine große Population von Kindern, die sich im letzten Jahrzehnt perinatal mit HIV infiziert haben, in die Pubertät hinein (3). Von den geschätzten 690.000 Menschen, die im Jahr 2019 an AIDS-bedingten Erkrankungen starben, waren 110.000 (oder etwa 16 %) Kinder unter 20 Jahren. (Globale und regionale Trends von UNICEF, Juli 2020).

Mit dem Aufkommen und der Skalierbarkeit der antiretroviralen Therapie (ART) ist weltweit ein Rückgang der AIDS-bedingten Todesfälle zu verzeichnen. Ende 2019 hatten 25,4 Millionen Menschen Zugang zu einer antiretroviralen Therapie, was 67 % aller Menschen mit HIV entspricht. Allerdings erhielten nur 53 % der mit HIV lebenden Kinder ART. Interessanterweise stammen etwa 94 % aller Kinder, die ART erhalten, aus SSA (4). Vor dem Hintergrund kontinuierlich neuer HIV-Infektionen bei Kindern und einer zunehmenden Abdeckung durch pädiatrische ART wird die Zahl der mit HIV lebenden Kinder zunehmen, was darauf hindeutet, dass die Wahrscheinlichkeit, das Jugendalter und sogar das Erwachsenenalter zu erreichen, höher ist, wenn die Behandlungsschemata bei der Kontrolle der HIV-Infektion weiterhin voll wirksam sind (3, 4). ADLHIV stellt daher eine HIV-Population mit wachsenden gesundheitlichen Bedenken dar und es gibt nur sehr begrenzte Erkenntnisse zu verallgemeinerbaren Best Practices speziell für diese Zielgruppe, insbesondere in SSA.

Wie mehrere west- und zentralafrikanische Länder ist Kamerun immer noch mit einer allgemeinen HIV-Epidemiologie konfrontiert (2,7 % Prävalenz) (5), mit einer höheren Prävalenz bei schwangeren Frauen (5,7 %) und HIV-exponierten Säuglingen/Kindern (5,8 % [958/16.638]). ] Positivität bei der ersten PCR und 15 % am Ende der PMTCT-Kaskade) (6). Im Juni 2018 betrug die landesweite Abdeckung von ART 51,5 % (281.083), darunter 12.362 Kinder unter 15 Jahren (6). Bezüglich der Reaktion auf ART in Kamerun berichteten wir über eine Gesamtrate von 79,4 % der Virussuppression, mit erheblichen Unterschieden zwischen den Altersgruppen: 81,1 % bei Erwachsenen, 75,6 % bei Kindern und nur 53,3 % bei Jugendlichen im Alter von 10 bis 19 Jahren (7). Ähnlich wie in UNAIDS-Berichten stellen Jugendliche mit HIV (ADLHIV) die am stärksten gefährdete und am stärksten unterversorgte Bevölkerungsgruppe als Reaktion auf die Epidemien dar (1, 5). Für ein sichereres Wachstum bis zum Erwachsenenalter muss dieser Bevölkerungsgruppe bei der Suche nach innovativen Behandlungsstrategien Vorrang eingeräumt werden, die ihr Wohlbefinden und ihren Beitrag zur Entwicklung von SSA gewährleisten.

Trotz der unbestrittenen Vorteile der ART gibt es bei den aktuellen Behandlungsstrategien Einschränkungen. Bemerkenswert ist, dass der lebenslange Charakter der aktuellen ART bei den meisten Patienten mit Herausforderungen im Zusammenhang mit der Therapietreue einhergeht, ART-bedingte Toxizitäten und anhaltende Immunschwächen zu erheblichen gesundheitlichen Beeinträchtigungen führen und die HIV-Arzneimittelresistenz (HIVDR) zunimmt, vor allem in den SSA-Ländern, in denen die meisten ART-erfahren sind Patienten leben (8). Es besteht die Gefahr einer neuen HIV-Epidemie, die durch HIVDR auf bestehende antiretrovirale Medikamente übertragen wird. Diese Herausforderungen gelten insbesondere für pädiatrische Bevölkerungsgruppen aufgrund begrenzter ART-Optionen, schlechter Arzneimittelformulierungen und zunehmender Fälle von Nichteinhaltung, wenn sie sich der Pubertät nähern. Diese Herausforderungen erfordern Ansätze zur (funktionellen) Heilung oder Remission von HIV, insbesondere für die am stärksten gefährdeten Bevölkerungsgruppen (d. h. ADLHIV) (7, 9).

Konzepte, die dem Projekt zugrunde liegen, einschließlich Ideen und Modelle oder Annahmen. HIV-1-Remissions- oder Eradikationsstrategien zielen darauf ab, eine Virusremission ohne antiretrovirale Therapie (ART) zu erreichen. Die Entwicklung eines Heilmittels gegen HIV-1 bleibt aufgrund der latenten Reservoire eine Herausforderung. Das latente HIV-1-Reservoir (LR) kann als der Anteil von Zellen definiert werden, die transkriptionell stille provirale DNA beherbergen und nach der Aktivierung in der Lage sind, infektiöse Virionen zu produzieren (10). Ruhende CD4T-Gedächtniszellen sind der Hauptwirt des LR, aber eine HIV-1-Infektion in diesen Zellen ist aufgrund ihrer geringen Co-Rezeptor-Expression und der inhärenten Einschränkungen der reversen Transkription ineffizient (11, 12). Dennoch gibt es Hinweise darauf, dass HIV-1 ruhende CD4T-Zellen direkt oder über eine Übertragung von Zelle zu Zelle infizieren kann, obwohl eine Infektion in diesen Zellen mit einer langsameren Replikationskinetik verbunden ist (13). Alternativ entsteht eine Latenz, wenn eine Untergruppe infizierter, aktivierter CD4T-Zellen zu einem Ruhegedächtnis-Phänotyp zurückkehrt, wodurch die virale Genexpression effektiv zum Schweigen gebracht wird, während die provirale DNA langfristig erhalten bleibt (14). Das Provirus wird in diesen Zellen durch Wirtsfaktoren wie epigenetische Unterdrückung, Abreicherung von Transkriptionsfaktoren wie NF-κB und Transkriptionsinterferenz aufgrund der Integration in exprimierte Gene in einem Ruhezustand gehalten, was ausführlicher besprochen wird (15). Nach Absetzen der ART kommt es schnell zu einer Viruserholung aus dem LR, was innerhalb von Wochen nach Therapieunterbrechung zu einer nachweisbaren Virämie führt (16). Darüber hinaus reicht die Einleitung einer ART zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion nicht aus, um die Bildung des LR zu stoppen, was sogar darauf hindeutet, dass der LR früh etabliert und verbreitet wird (Chun et al., 1998; Whitney et al., 2014; Colby et al., 2018). bei vertikal infizierten Kindern, die kurz nach der Geburt mit ART begannen (17). Das latente Reservoir ist trotz jahrelanger supprimierender ART stabil und ist die Quelle einer Rebound-Virämie nach Therapieunterbrechung. Latent infizierte Zellen stellen daher das Haupthindernis für eine Heilung von HIV-1 dar und sollten gezielt durch neue Behandlungs- und Eradikationsstrategien angegangen werden.

Der Fortschritt bei der Entwicklung eines funktionellen oder sterilisierenden Heilmittels für HIV-1 wurde durch die Anwesenheit des LR erheblich behindert. Derzeit wurden zwei Menschen von einer HIV-1-Infektion geheilt, die sogenannten Berliner und Londoner Patienten, die seit der allogenen Stammzelltransplantation von CCR5?32/?32-Spendern seit über 10 und 2 Jahren durchgehend negativ auf einen Virus-Rebound getestet wurden Jahre bzw. ohne ART (18). In diesen Fällen wurde der infizierte Zellpool während der Konditionierung vor der Transplantation erheblich dezimiert und durch Spenderzellen ersetzt, die aufgrund einer großen Deletion im CCR5-Co-Rezeptor gegen eine Infektion mit dem R5-Tropenvirus resistent sind (19). Aufgrund des relativen Mangels an CCR5 ?32/?32-Spendern und der besonderen Umstände, die diese Fälle bestimmen, ist diese Art der Heilung für eine breite Anwendung nicht durchführbar, betont jedoch das Grundprinzip der HIV-1-Heilung; das HIV-1-LR zum Schweigen bringen oder ausrotten (20). Im Laufe des letzten Jahrzehnts hat sich das Verständnis darüber, wo und wie HIV bei ART-Patienten fortbesteht, erheblich verändert, da nachgewiesen wurde, dass das Virus in mehreren Zelltypen und Gewebestellen sowie sowohl in ruhenden als auch proliferierenden, langlebigen, latent infizierten Zellen persistiert. Daher würden im Rahmen einer unterdrückenden Behandlung genaue Schätzungen des Virusreservoirs dazu beitragen, die Viruspersistenz besser zu beherrschen, was wiederum bestehende Hindernisse für eine Heilung überwinden könnte (21).

Die Gesamt-HIV-DNA ist ein Referenzbiomarker, der sowohl integrierte als auch nicht integrierte HIV-DNA umfasst und die globale Ebene des Virusreservoirs widerspiegelt. Wichtig ist, dass Buzon et al. berichteten über eine statistische Korrelation zwischen der Zeit von der HIV-Infektion bis zum Beginn der Behandlung und dem gesamten HIV-DNA-Spiegel nach 10 Jahren kontinuierlicher Behandlung in einer Kohorte von Erwachsenen, die erstmals mit einer frühen Infektion behandelt wurden (22). Bei Kindern war der HIV-DNA-Spiegel deutlich niedriger, wenn die Viruskontrolle vor dem Alter von einem Jahr erreicht wurde (23). Im Vergleich zu anderen Markern hat die gesamte HIV-DNA den Vorteil einer einfachen Quantifizierung durch standardisierte, empfindliche Echtzeit-PCR, einschließlich digitaler Tröpfchen-PCR (ddPCR) (24).

Eine generalisierte Immunaktivierung ist ein Kennzeichen einer HIV-1-Infektion. In diesem Zustand zeigen verschiedene Immunzellen eine erhöhte Expression von Aktivierungs-, Proliferations- und apoptotischen Markern, einen Zellumsatz mit fehlerhafter Regulierung des Zellzyklus, eine Produktion entzündungsfördernder Zytokine und eine erhöhte Fibrose des lymphatischen Gewebes (25). Die Immunaktivierung ist stark mit dem Fortschreiten der HIV-1-Erkrankung verbunden. Beispielsweise ist die T-Zell-Aktivierung, gemessen durch die Expression von CD38 und HLA-DR, besser auf die Depletion von CD4+T-Zellen und ein kürzeres Überleben zurückzuführen als die Viruslast im Plasma (26, 27). Darüber hinaus lässt der Grad der Immunaktivierung zu Beginn einer HIV-1-Infektion, gemessen anhand der Aktivierung von CD8+T-Zellen, den Verlust von CD4+T-Zellen unabhängig von den Plasma-HIV-1-RNA-Spiegeln vorhersagen (28). Die Unterdrückung der Virusreplikation durch eine wirksame antiretrovirale Behandlung (ART) verringert die Immunaktivierung, aber selbst wirksame ART-Therapien sind nicht in der Lage, das Ausmaß der Immunaktivierung bei HIV-infizierten Personen auf das Niveau gesunder Personen zu senken (25). HIV-infizierte Kinder sind, selbst wenn sie erfolgreich mit ART behandelt werden, ein Leben lang mit einer erhöhten Immunaktivierung konfrontiert. Daher ist die Bewertung der möglichen Auswirkungen chronischer Immunaktivierung und Entzündung auf das sich entwickelnde Immunsystem und auf den Krankheitsverlauf bei pädiatrischen HIV-Infektionen von besonderer Bedeutung. Jüngste Studien zeigten, dass Immunaktivierungs- (HLA-DR, CD38) und Erschöpfungsmarker (Tim-3, PD-1, Lag-3) stark mit der Reservoirgröße bei ART-behandelten Erwachsenen verbunden sind, sodass zu erwarten ist, dass die Virusinfektion minimiert wird Ein Reservoir mit früher ART könnte ebenso das Ausmaß der Immunaktivierung und die nicht-AIDS-bedingten „Alterungskrankheiten“, die mit einer anhaltenden Immunaktivierung einhergehen, minimieren.

Es gibt nur begrenzte Belege für die Charakterisierung von HIV-Reservoirs in der Region West- und Zentralafrika, einem geografischen Gebiet mit der höchsten Variabilität bei den zirkulierenden HIV-1- und HIV-2-Stämmen (29, 30). Kamerun beispielsweise, ein zoonotisches Epizentrum von HIV-1, beherbergt eine äußerst vielfältige HIV-Landschaft, die durch die CRF02_AG-Rekombinante angetrieben wird, einschließlich der meisten Subtypen der Gruppe M (Subtypen), einer Vielzahl von URFs und CRFs sowie der Gruppe N. O-, P- und HIV-2-Viren (31-33). Daher würde die Generierung von Basisdaten zum genotypischen und quantitativen Profil des Virusreservoirs über mehrere HIV-Gruppen in einem Umfeld wie Kamerun hinweg die Entwicklung optimaler Strategien zur HIV-Heilung beeinflussen. In Anbetracht der oben genannten Anfälligkeit von Jugendlichen mit vertikaler Infektion und des begrenzten Wissens über Virusreservoirs und Immunaktivierung/Entzündungsreaktion in dieser Population werden die aus diesem Ziel gewonnenen Erkenntnisse die aktuellen globalen Bemühungen in hohem Maße ergänzen. Solche Beweise, die vor dem Hintergrund einer hohen Belastung durch Koinfektionen generiert wurden (34, 35), könnten unterschiedliche Mechanismen der HIV-Persistenz aufzeigen, die weit von denen abweichen, über die in anderen Teilen der Welt berichtet wird.

Vorarbeit:

Im Rahmen der laufenden EDCTP READY-Studie haben wir eine Kohorte von 292 vertikal infizierten Jugendlichen (10-19 Jahre) erstellt, die in Kamerun ART erhalten. In dieser Kohorte berichteten wir über eine Rate von 40 % nicht nachweisbarer Viruslast (<40 Kopien/ml) nach durchschnittlich 8 Jahren ART, eine Rate von etwa 20 % immunologischem Versagen (CD4<250 Zellen/mm3) und weniger als 10 % klinisches Versagen Scheitern (d. h. WHO-Stadien III/IV) (36). Diese Population bietet eine einzigartige Gelegenheit zum Verständnis der Größe und Beschaffenheit des Reservoirs, der Variabilität der Immunantwort/Zytokinprofilierung und der Auswirkung des viralen Subtyps, der Behandlungsgeschichte (ART-Regime und -Dauer), der Geschlechterunterschiede und des Adhärenzniveaus auf die Kontrolle von virales Reservoir.

ZIEL:

Ziel dieser Studie ist es, HIV-Reservoirs und ihre Variabilität anhand der virologischen und immunologischen Profile vertikal infizierter Jugendlicher, die in Kamerun eine antiretrovirale Therapie erhalten, zu charakterisieren und so das Verständnis der Virusreservoirs zu verbessern und genaue und zuverlässige Daten für die HIV-Heilungsforschung bereitzustellen.

Bestimmte Ziele:

In dieser Studie werden wir: 1- die genetische Variabilität und Arzneimittelresistenz von HIV-1 in zellulären Reservoirs bestimmen; 2- Charakterisierung der Immunaktivierung/-entzündung bei Jugendlichen, die vertikal mit HIV-1 infiziert sind; 3- Bewerten Sie die Größe des HIV-Reservoirs; 4- Bewerten Sie die Wirkung der antiretroviralen Therapie und der Immunantwort auf das Virusreservoirprofil.

Materialien und Methoden Studiendesign Wir planen die Durchführung einer Beobachtungs- und Vergleichsstudie unter Jugendlichen, die mit HIV leben und ART in Kamerun erhalten. Die Teilnehmer werden aus einer bestehenden Kohorte von fast 300 vertikal infizierten Jugendlichen ausgewählt und eingeschrieben, die für die EDCTP-READY-Studie rekrutiert wurden.

Das Hauptziel der EDCTP-READY-Studie bestand darin, das Ansprechen auf die Behandlung, die Arzneimittelresistenz und die HIV-1-Variabilität bei Jugendlichen unter antiretroviraler Erst- und Zweitlinientherapie in Kamerun zu bewerten (7). In dieser Studie haben wir 296 HIV-positive Jugendliche rekrutiert und das genotypische Profil von HIV-1 in zirkulierender RNA verglichen. Bei 30 % (89/296) APHI kam es zu einem virologischen Versagen (VL > 1000 Kopien/ml).

Probenahmeverfahren:

Den Teilnehmern der EDCTP-READY-Studie werden gemäß den Zulassungskriterien Blutproben entnommen.

Zulassungskriterien:

Einschlusskriterien: In die Studie werden HIV+-Jugendliche im Alter von 10 bis 19 Jahren aufgenommen, die vertikal infiziert sind, seit mindestens 12 Monaten ART erhalten, ihre schriftliche Einwilligung erteilen und deren Erziehungsberechtigter eine schriftliche Vollmachtsermächtigung erteilen.

Nichteinschlusskriterien: Werden bei der Einschreibung nicht berücksichtigt, HIV+-Jugendliche mit unvollständiger ART-Anamnese, HBV/HCV- und Malaria-Koinfektionen.

Ausschlusskriterien: Als von der Studie ausgeschlossen gilt jeder Teilnehmer, der sich freiwillig dazu entschließt, die Teilnahme zurückzuziehen, nachdem er sein Einverständnis gegeben hat oder nicht in der Lage ist, eine Blutprobe abzugeben.

Stichprobengröße: Die Mindeststichprobengröße (N) der Studie beträgt 90 Teilnehmer und wird anhand der folgenden Formel berechnet: N=p (1-p) (Zα2/α2); N = 0,02(1-0,02) (1,962/0,052) = 30 pro Arm (Arm-A: VL<40 Kopien/ml; Arm-B: VL 40-999 Kopien/ml; Arm-C: Viruslast ≥1000 Kopien/ml). P ist die Prävalenz von Jugendlichen mit HIV in Kamerun mit P = 2 % [3]; Da α das Risiko ist, stimmt es mit α = 5 % überein; Zα ist die kleine Lücke mit Zα = 1,96.

NB: Eine Gruppe von 30 HIV-negativen Jugendlichen dient als Kontrolle für das immunologische Profiling.

Allen Teilnehmern wird eine neue Identifikationsnummer zugewiesen und die Daten werden in einem passwortgeschützten Computer im Internationalen Referenzzentrum Chantal Biya (CIRCB) für Forschung zu HIV/AIDS-Prävention und -Management zentralisiert.

Studienverfahren und Variablen Verfahren und Zeitpläne Die vorliegende Studie benötigt 18 Monate, um abgeschlossen zu werden: 3 Monate (Monat 1-3) für die Verwaltung und Ethikgenehmigung, 12 Monate (Monat 4 bis 15) für die Registrierung der Teilnehmer, Probenahmen und Laboranalysen, 3 Monate (Monat 16 bis 18) für die Datenverarbeitung und Berichterstellung, weitere Einzelheiten finden Sie im Gantt-Diagramm.

Basierend auf Einschlusskriterien werden Fallberichtsformulare für HIV+-Jugendliche aus der EDCTP-READY-Studie ausgewählt und ihr Erziehungsberechtigter wird kontaktiert. Die Zustimmung und die Einverständniserklärung des Bevollmächtigten werden von Jugendlichen bzw. Erziehungsberechtigten eingeholt. Soziodemografische, klinische Daten und ART-Anamnese werden für den Zeitraum während der Einschreibung in die EDCTP-READY-Studie erneut ausgewertet. Dann werden 90 oder mehr HIV+-Jugendliche [30 pro Arm (Arm-A: VL<40 Kopien/ml; Arm-B: VL 40-999 Kopien/ml; Arm-C: Viruslast ≥1000 Kopien/ml)] eingeschrieben . Eine Gruppe von 30 HIV-negativen Jugendlichen wird als Kontrolle für die immunologische Profilerstellung aufgenommen. Intravenöses Blut (5 ml x 2) wird von einem ausgebildeten Phlebotomiker für Laboranalysen gesammelt, einschließlich PBMC-Isolierung, Plasma- und Buffy-Coat-Isolierung, CD4/CD8-Zahlen, plasmatische Viruslast (PVL), Beurteilung der Immunaktivierung/Entzündungsmarker, HIV-RNA usw HIV-DNA-Genotypisierung, Quantifizierung viraler Reservoirs.

HIV-negative Teilnehmer werden am CIRCB rekrutiert. Diese Einrichtung ist seit 2006 ein Referenzzentrum für die Behandlung HIV-infizierter Personen und als solche ein renommiertes Referenzzentrum für HIV-Tests. Basierend auf diesem Vorteil organisiert CIRCB pro Jahr kostenlose HIV/HBV/HCV-Screeningtests für mehrere Institutionen und Gemeinden. Daher wird eine ähnliche kostenlose Testkampagne in einer nahegelegenen weiterführenden Schule organisiert und die vorliegende Studie wird denjenigen vorgestellt, die die Einschlusskriterien erfüllen . Potenzielle Teilnehmer werden zusammen mit ihrem Erziehungsberechtigten zur Anmeldung zum CIRCB eingeladen.

Bei der Einschreibung werden nur einmal Proben sowie alle relevanten soziodemografischen und klinischen Daten erhoben. Die Proben werden noch am selben Tag zur PBMC-Isolierung, DNA-, Plasma- und Buffy-Coat-Isolierung, CD4/CD8-Zählung und Aktivierungs-/Entzündungsmarkerbewertung mittels Durchflusszytometrie zum CIRCB transportiert. Das Plasma wird gesammelt und bei -80 °C für die plasmatische Viruslast (PVL), die Genotypisierung und die Beurteilung der Immunaktivierung/Entzündungsmarker mittels ELISA-Tests (oder Durchflusszytometrie) gelagert. Anschließend wird HIV-DNA aus PBMCs extrahiert und bei -80 °C gelagert; HIV-DNA wird alle drei Monate zur Quantifizierung des HIV-Virusreservoirs an die Abteilung für experimentelle Medizin der Universität Rom Tor Vergata, Rom, Italien, geschickt (siehe Kooperationsschreiben im Anhang).

Laborverfahren CD4/CD8-Anzahl: CD4/CD8-Messungen werden mit einem Durchflusszytometriegerät wie zuvor beschrieben bestimmt (37).

Plasmaviruslast: Die Plasmaviruslast wird mit dem Abbott-Echtzeitsystem m 2000rt wie zuvor beschrieben bestimmt (38).

HIV-RNA-Extraktion: ARN wird aus Plasmaproben mit dem Qiamp viral RNA Mini Kit (Qiagen) extrahiert, wie vom Hersteller beschrieben.

Provirale DNA-Extraktion aus Buffy Coat: Provirale DNA wird mit dem DNeasy Blut- und Gewebeextraktionskit (Qiagen) wie vom Hersteller beschrieben extrahiert.

Isolierung von PBMCs: PBMCs werden durch Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll unter Verwendung eines hauseigenen Protokolls isoliert.

HIV-DNA-Extraktion aus PBMCs: HIV-DNA wird mit dem QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen) wie vom Hersteller beschrieben extrahiert.

Amplifikation und Sequenzierung von HIV-1-Genen: Die Sanger-Sequenzierung für HIV-1-Arzneimittelresistenztests wird bei Jugendlichen mit virologischem Versagen durchgeführt, ein internes Protokoll, wie zuvor von unserer Forschungsgruppe beschrieben(39). Reverse-Transkriptase-DNA-Sequenzen werden mithilfe des Interpretationsalgorithmus für genotypische Resistenzen in der Datenbank der Stanford University (www.stanford.edu) auf Arzneimittelresistenzmutationen analysiert.

Phylogenetische Analyse: Neighbor Joining phylogenetische Bäume werden mit der MEGA-Software (Kimura 2-Parameter-Modell, 200 Bootstrap-Replikationen) und FigTree (40, 41) erstellt.

Immunprofilierung: Beide Immunaktivierungs-/inflammatorischen Zytokine (IL-1, IL2, IL4, IL6, IL10, IL12 und TNF-alpha) werden mithilfe kommerzieller ELISA-Kits und Durchflusszytometrie bewertet.

Quantifizierung von HIV-Virusreservoirs: Virusreservoirs werden mithilfe der digitalen Tröpfchen-PCR (ddPCR) wie zuvor beschrieben quantifiziert. Bemerkenswert ist, dass diese Quantifizierung in der Abteilung für experimentelle Medizin der Universität Rom Tor Vergata, Rom, Italien, durchgeführt wird, wie im Kooperationsschreiben im Anhang dieses Vorschlags angegeben. Vor dem Versand der Proben an UTV wird zwischen CIRCB und UTV eine Materialtransfer- und Datenaustauschvereinbarung unterzeichnet. Es handelt sich um ein internes Protokoll für den HIV-1-B-Subtyp und wird an die aus kamerunischen Proben erwarteten HIV-1-Nicht-B-Subtypen angepasst.

Datenanalyse Die während der Studie gesammelten Daten werden mithilfe der SPSS-Software analysiert. Zugehörige Faktoren werden mithilfe einer multivariaten logistischen Regression bewertet, mit einem Schätzansatz für die unvoreingenommene Wirkung verschiedener Parameter. Die Daten werden als Median angegeben. Für Daten, die nicht normalverteilt sind, werden nichtparametrische Tests verwendet. Vergleiche der Mediane zwischen verschiedenen Gruppen (virologischer Erfolg vs. virologisches Versagen) werden mit dem U-Mann-Whitney-Test durchgeführt. Korrelationen werden mit dem Spearman-Test hergestellt und p-Werte unter 0,05 werden als statistisch signifikant angesehen.

Ethische Überlegungen Diese Studie wird gemäß der Erklärung von Helsinki zu ethischen Grundsätzen für die medizinische Forschung an menschlichen Probanden durchgeführt. Die ethische Genehmigung wird von der nationalen Ethikkommission Kameruns für Forschung zur menschlichen Gesundheit eingeholt. Nach einer informierten Mitteilung über die Studie wird vom Erziehungsberechtigten eine schriftliche Vollmacht eingeholt, und auch vom teilnehmenden HIV-positiven Jugendlichen wird ohne Zwang eine schriftliche Zustimmung eingeholt. Privatsphäre und Vertraulichkeit werden durch die Verwendung eindeutiger Kennungen und einer passwortgeschützten Datenbank gewährleistet und der Zugriff erfolgt nur durch autorisiertes Personal. Den Teilnehmern steht es frei, die Studie jederzeit bewusst zu verlassen, ohne dass dies Auswirkungen auf ihre routinemäßige Überwachung in der Studienklinik hat. Die Phlebotomie erfolgt nicht-invasiv (Venenpunktion) und wird von einer ausgebildeten Krankenschwester durchgeführt.

Qualitätskontrolle:

Zu unserem Studienteam gehört ein Qualitätssicherungsbeauftragter, der für alle SOPs des Studienprotokolls verantwortlich ist und während der gesamten Studie die Eignungsprüfung und Datenvalidierung verwaltet.

Umgang mit potenziellen Risiken: Die Risiken für die Patienten sind minimal, da der einzige Eingriff, dem der Freiwillige unterzogen wird, eine Venenpunktion durch einen Phlebotomiker oder Arzt ist. Die Venenpunktion kann leicht schmerzhaft sein, ist aber praktisch komplikationslos. Zu den potenziellen Risiken für die Probanden, die wahrscheinlich nicht eintreten, gehören vorübergehende Schmerzen, Blutergüsse an der Stelle oder eine mögliche (aber äußerst unwahrscheinliche) Infektion. Sollten solche Komplikationen auftreten, wird dem Teilnehmer eine medizinische Notfallbehandlung bereitgestellt.